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分子生物学
绪论
一、学科定义
分子生物学是在分子水平研究生物结构和功能，研究生命现象的物质基础和揭示生命过程的基本活动规律的学科。主要是指遗传、生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。 二、研究对象、主要内容
1． 对象：从广义的讲：蛋白质及核酸等所有生物大分子结构和功能的研究都属于分子生物学的范畴。
2． 主要内容
我们学习的基础分子生物学主要包括以下内容： DNA、染色体及基因组（分子生物学的物质基础）
DNA的复制与修复（遗传信息的世代传递，确保其精确的机制） 基因重组（生物变异与进化）
RNA的生物合成（遗传信息传递中的转录过程，转录后的加工） 蛋白质的生物合成（遗传信息传递中的翻译过程，遗传密码子）
基因表达调控（基因的时序表达；3～4万个蛋白质编码基因是否意味着只有3万种蛋白质） DNA操作技术（分子生物学发展的基础、工具) 三、发展简史 1．理论基础阶段
分子生物学是一门深层的理论与实验科学，它必须在自然科学发展到一定的深度后才逐渐形成。尤其得益于细胞学、遗传学和生物化学的发展。 2．形成发展阶段
由于核酸化学的发展，1953年美国科学家Watson和英国科学家Crick在前人的基础上（Chargaff, Wilkins及Franklin等），提出了DNA的双螺旋结构模型，为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路（即本课程中第二章的基础）。
分子生物学的研究对生命科学的发展起着巨大的推动作用，受到国际科学界的高度重视，据统计从1910年到2001年，约50多人次科学家荣获诺贝尔化学奖及生理医学奖。 3．未来发展阶段
就基因组研究来说，它遵循的基本思路是：基因组→转录组→蛋白质组。 四、分子生物学在生命科学中的位置
1．分子生物学是从生物化学发展出来的一门科学。
2．分子生物学与微生物关系密切，曾认为分子生物学主要是E.coli的分子生物学。 3．与遗传学的关系，均涉及到遗传信息的载体及传递过程，为相辅相成的学科。 这些学科的关系，再一次证明了学科交叉是当代科学研究的特征与要求。 分子生物学的三大原则
★ 构成生物大分子的单体是相同的 ★ 生物遗传信息的表达的中心法则相同
★ 生物大分子单体的排列（核苷酸，氨基酸） 高级结构
个性
生物大分子之间的互作
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第一章 DNA、基因组及染色体
主要内容：进一步了解DNA的高级结构——超螺旋的相关知识，解释拓扑异构现象；学习染色体的组成及构造层次；学习基因概念，基因组的大小、复杂性，以及原核与真核生物基因组的区别。
§1-1 DNA超螺旋及拓扑异构现象
一、超螺旋（superhelix or supercoil）
共价封闭环（covalently closed circle, 简称cccDNA 分子）： 超螺旋：指双螺旋环状分子再度螺旋化即成为超螺旋结构。 二、超螺旋的方向性（正超螺旋与负超螺旋）
1．松弛（relaxed）状态（双螺旋轴没有“净弯曲缠绕”）：DNA在水溶液中, 构型偏B型状态。DNA以10.5 bp/helix为最稳定构型。
2．正超螺旋：小于10.5bp/helix，则其二级结构处于紧缩状态，由此产生的超螺旋为正超螺旋。 3．负超螺旋：大于10.5bp/helix，则其二级结构处于松缠状态，由此产生的超螺旋为负超螺旋。 三、DNA超螺旋的拓扑学定义（1969年 White等） 1． 数学式描述DNA超螺旋： Lk = Tw + Wr Lk：链环数，Tw：缠绕数，Wr：扭曲数。
Lk具有拓扑性质。如果闭合环形DNA分子的任意一条链上有切口，Lk值就不确定了。 例题：见教材P84～85。
2．比连系差（Specific linking difference）σ
Lk- Lk0 △Lk
σ = = L
Lk0 k0
3．DNA超螺旋的生物学意义
1. 超螺旋DNA具有更紧密地形状，因此在DNA组装中具有重要作用；
2. DNA的结构具有动态性，DNA超螺旋程度的改变介导了这种结构的变化，这有利于其功能的
发挥。
3. DNA是一种热力学上的稳定结构，超螺旋的引入提高了它的能量水平。 四、DNA的拓扑异构体（topoisomer）
1．DNA的拓扑异构体；具有不同连接数的同一种DNA分子称为DNA的拓扑异构体。即在保持DNA一级和二级结构不变的情况下，两条单链可以相互缠绕，形成不同的空间构型。
2. DNA拓扑异构酶：细胞内存在着一类能催化DNA拓扑异构体相互转化的酶称为～。 3. 其他影响因素
§1-2 基因和基因组
一、基因相关概念 1.基因(gene)：：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列，在遗传学上也称顺反子。 基因家族：真核生物的基因组中有许多来源相同，结构相识，功能相关的基因称为基因家族。一个基因家族的不同成员常编码有相似但不完全相同氨基酸序列的蛋白质，每个成员的表达水平也可不同。据估计，高等植物中有20 000～30 000个不同得基因家族
假基因：在多基因家族中某些成员并不产生有功能的基因产物，但其结构和DNA序列与有功能的基因具有相似性。 2.基因组（genome）：指DNA分子所携带遗传信息总和，即指一个细胞所有基因和基因间DNA的总和，称基因组。遗传学定义为：一个物种的单倍体的染色体的数目为该物种的基因组。 二、基因组的大小与C值矛盾 1．C值 （C-value）：是指某物种单倍体基因组的全部DNA含量的总和。不同物种的C值差异很大。 2．C值矛盾或C值悖理（C-value paradox）：①与预期相比，C 值明显过大；②同一物种，C 值相
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差很大。这种C值与生物进化复杂性不相对应的现象称为C值矛盾或C值悖理
三、基因组的复性动力学 1.C0t曲线（S形曲线）：C/C0 = 1/（1+ K C0t） 2. DNA复杂度（complexity）
3. C0t曲线与DNA大小及复杂度的关系 四、重复序列
1．单一序列：主要是蛋白质编码基因。
2．中度重复序列：包括rRNA、tRNA、组蛋白的编码基因。研究较多的是Alu家族。 3．高度重复序列
长度不到10bp，多是串联集中分布，一般不转录。有些AT含量很高的高度重复序列，在离心时常会在主要的DNA带的上面有一个次要的DNA带相伴随，这就是所谓的“卫星DNA”。
（1）卫星DNA（satellite DNA）特点：①它们都是由极其相似的重复拷贝首尾相连串联排列；②在介质氯化铯作密度梯度离心时，可形成特异的卫星带，故又称卫星DNA。③集中分布在染色体的特定区段。 有关高度重复序列主要例子是着丝点（centromere）和端粒（telomere）结构。 （2）着丝点：）每个染色体有一个着丝点，它的作用是为蛋白质提供一个附着点，使染色体和有丝分裂纺锤体的微管相联接，这个附着点是细胞分裂期间把染色体正确地分离，分配到子代细胞所必需的。对着丝点功能必需的DNA序列约130bp长，并富含A=T碱基对；更高等的真核生物着丝点DNA更长一些。在着丝点序列附近还有高度重复的卫星DNA。
（3）端粒是位于真核生物线性染色体末端的DNA序列。一些较为简单的真菌细胞染色体端粒DNA研究得比较清楚。酵母的端粒序列约长100碱基对，是由
5′-（TxGy）n 和 3′-（AxCy）n 其中 x在1～4之间，y在1～8之间。
4．反向重复序列：又称回文序列（palindrome），单链易形成发夹结构，在DNA双链中可能形成十字形结构（同一链可以互补）。这是真核DNA中再结合最快的部分，约占某些基因组的10%。复性动力学的研究表明，它的复性为一级反应，说明这种DNA含有靠得很近的反向重复（自我互补）序列，它们能够自我折叠起来形成发夹结构。
CATGAACGTCCTATTGTCGGACGTTCTGA
GTACTTGCAGGATAACAGCCTGCAACACT
重复序列虽然没有编码功能或很少编码序列（如编码转座酶的转座子），但它们对基因组的结构与整合可能仍然起重要作用。
五、断裂基因（split gene）
1.断裂基因定义：也叫不连续基因，指在真核生物中，大多数编码蛋白质的基因是不连续的，即基因的编码序列之间插入了不编码的序列，称为断裂基因。 2.内含子的意义
（1）多数基因中内含子没明显功能，可能是遗传的残留物。
（2）Walter Gilbert假说：编码蛋白质基因是由外显子的集成产生的，这种集成过程是通过内含子序列间的重组将外显子聚集在一起的。因此，现在看到的内含子是促使蛋白质进化过程的残迹。如对低密度脂蛋白（LDL）受体基因序列的分析。
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（3）内含子可以保护基因家族中基因的完整性，即保护基因家族中相邻近的外显子不被不等交换（unequal crossing-over）所消除，内含子可抑制由于碱基序列相似而产生的错配过程，从而防止这种形式的降解。
（4）有些可以编码蛋白质（如酵母线粒体细胞色素氧化酶），在某些基因的转录中作为调控成分。 六、真核与原核生物基因组比较（ P78 ）
§1-3 染色体（chromatography）
一、真核生物染色体
1. 核小体色质是由重复单位构成的，每个重复单位由约200bp的DNA和H2A、H2B、H3、H4各两分子组成，这个重复单位叫核小体。
2. 组蛋白：五种： H1、H2A、H2B、H3、H4。呈碱性。
除了H1以外，其余四种有相互作用形成聚合体的趋势。它们通过C端的疏水氨基酸相互结合，而N端的碱性氨基酸则向四面伸出以便与DNA分子相互作用。 3. 核小体包装的高级形式
每个核小体含8个组蛋白；200bp DNA中，146bp 紧紧缠绕着组蛋白，其余用于连接两个核小体，称为连接DNA（linker DNA）。H1通常和连接DNA相结合，把核小体“封锁”起来。 二、原核生物染色质 思考题：
1. 为什么生物体内多以负超螺旋形式存在？
2. 试述原核生物和真核生物基因组的特点及它们的区别。
第二章 DNA的复制与损伤修复
§2-1 DNA复制的概况
DNA复制是一个由多种酶催化和有多种蛋白质参与的受到精密调控的过程； DNA是细胞中唯一具修复系统的生物大分子。 一、DNA复制的半保留性
二、复制的起点、方向和速度（即顺序性）
1.起点（原点 origin） 许多实验证明，DNA的复制是由固定的起始点开始的
复制子：一般把生物体的独立复制单位称为复制子。一个复制子只含有一个复制起点。 2． 复制方向
涉及领头链、后随链的复制。新链方向均为5′-3′方向。 3． 复制速度
比较原核生物与真核生物的复制速度。 4． 复制的方式：半保留复制
§2-2 DNA复制的酶和相关蛋白
一、DNA聚合酶
特点：1.以4种dNTP为底物；2.反应需要接受模板指导；3.反应需要有3’-OH存在；4.DNA链的合成方向为5 ’ 3 ’；5.产物DNA的性质与模板相同。 1．DNA聚合酶I
DNA聚合酶I是多功能酶，包括
5 ’ - 3 ’聚合酶活性：将dNTP加到DNA链的3′-OH上，DNA的聚合功能。
3 ’ - 5 ’核酸外切酶活性：从3′端将DNA链水解， DNA的校对（proofreading）功能。 5 ’ - 3 ’核酸外切酶活性：从5′端将DNA链水解，DNA的修复功能。
klenow片断：用枯草杆菌蛋白酶处理可以将DNA聚合酶I水解为一大一小两个片段。较大的C末端片断分子量为68KD，叫klenow片断，具有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的外切酶活性，常用做体外合成DNA的工具酶。
切口平移：DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性从5′端切除DNA受损伤的部位，DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶活性随即开始工作，使DNA链向3′端延伸，这称为切口平移（nick translation）。
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