发布时间 : 星期二 文章脲酶活性&蛋白溶解度测定方法更新完毕开始阅读
出口大豆饼粕脲酶活性测定方法pH增值法、盐酸中和法
1.适用范围
本方法适用于大豆饼粕类脲酶活性的测定。 2.方法一 2.1.术语
脲酶活性：在规定的操作条件下，使试样中的脲酶分解尿素释放出氨基氮，以溶液pH值的变量表示。 2.2.原理概要
将研细的试样与缓冲尿素溶液混合，在30℃作用30min后，测定溶液的pH值。 2.3.主要试剂和仪器 2.3.1.主要试剂
磷酸缓冲溶液：将3.403g KH2PO4和4.355g K2HPO4溶解并稀释至1000mL。临用前，以强酸或强碱调节其pH至7.0，其使用期限不超过90d；
缓冲的尿素溶液：溶15g尿素（NH2CONH2）于500mL磷酸缓冲溶液中。加入5mL甲苯，用于防腐和防止霉菌生长。按上法调节其pH至7.0。 2.3.2.仪器
分析天平：感量0.1mg；
研磨器：易于清理，研磨过程中不发热，并能达到要求的磨粉细度； 恒温水浴：能控制于30±0.5℃；
pH计：备有玻璃电极和甘汞电极，灵敏度不低于±0.02pH单位，同时附有温度补偿；
试管：直径22mm，长150mm，具橡胶塞； 烧杯：容量10mL； 单刻度移液管：10mL； 精密计时器； 标准筛。 2.4.试样的制备
用研磨器将约10g的样品，在不升高温度的条件下尽可能研细，使其通过60目标准筛的量不少于60％。收集全部磨碎物于广口瓶中，小心混合并立即进行分析。 2.5.过程简述
准确称取试样0.200g，放入试管内，加10mL缓冲的尿素溶液，塞好橡胶塞，混匀。置于30±0.5℃水浴中，记下时间。隔5min放入第二个与此相同的试管作重复试验。 另称试样0.200g，放另一试管内，加10mL磷酸缓冲溶液，塞好橡胶塞，混匀，作为空白试验。与上管间隔5min置于同一水浴中。
在消化过程中，每隔5min将试管内容物都摇匀一次。每个试管都在消化30min后，从水浴中取出，倒出上清液于小烧杯中。并在从水浴中取出后恰好5min时，测定pH值读数。
注意：pH计测定前须预热30min以上，玻璃电极须在蒸馏水中浸泡活化24 h以上，方可使用；防止所有玻璃容器或电极的污染。如果pH计不能迅速给出稳定的读数，即应查清故障。甘汞电极的多孔组织如蒙上了大豆的可溶性成分，常可引起偶然故障。 2.6.结果计算
将主体试验的pH值减去空白试验的pH值，其差值作为脲酶活性。 2.7.允许差
对于蒸熟的或未经蒸熟的产品来说，同一实验室内的双试验结果允许差各自为
0.03和0.10pH单位。 3.方法二 3.1.术语
脲酶活性：指在下述操作条件下，试样的脲酶分解尿素释放氨基氮的量，以每克样品每分钟释放的氨基氮的毫克数表示。 3.2.原理概要
将研细的试样与缓冲尿素溶液混匀，在30℃静置30min后，加入过量盐酸溶液中和所释放的氨，然后用氢氧化钠标准溶液反滴。 3.3.主要试剂和仪器 3.3.1.主要试剂
缓冲尿素溶液：pH6.9～pH7.0。将4.45g二水磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O）和3.40g磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于水，稀释至1000mL制得缓冲溶液。溶30g尿素（NH2CONH2）于缓冲液。这样制备的缓冲尿素溶液保存期为一个月；
盐酸标准溶液：c（HCl）＝0.1mol／L； 氢氧化钠标准溶液：c（NaOH）＝0.1mol／L。 3.3.2.仪器
标准筛；
电势滴定器或pH计：感量为0.02 pH单位，备有自动滴定管和电磁搅拌器； 滴定瓶或50mL烧杯；
试管：直径18mm，长150mm，配有磨口内塞。其他仪器见2.3.2条。 3.4.样品的制备
用碾磨器将样品约10g碾至颗粒能全部通过孔径为80目的筛层。
在产品特殊的情况下（如高水分和含有高挥发性物质的产品），可先在室温下进行预干燥处理后，再研磨。并在计算结果时，把由于预干燥处理而造成的质量损失考虑在内。
3.5.试样的抽取
于试管中称取试样约0.2g，准确至0.1mg。 对于酶活性非常高的样品，试样可减至0.05g。 3.6.过程简述
用移液管加入10mL缓冲尿素溶液于盛有试样的试管中，迅速加塞并用力振摇，立即将试管放入30±0.5℃的恒温水浴中，保持30min，用精密计时器计时，立即用移液管加入10mL盐酸溶液，迅速冷却至20℃，并将试管中的内容物无损失地移入滴定瓶中，把试管用每份5mL的蒸馏水冲洗两次。
迅速用氢氧化钠标准溶液回滴至pH4.70，最好用电势滴定器。 隔5min放入第二个与此相同的试管作重复试验。
另取同样试管，加入与主体试验等量的样品，再加入10mL盐酸溶液和10mL缓冲尿素溶液，作为空白试验。立刻加塞并用力振摇。随即放入同一水浴中，与主体试验同样的方法，恒温保持30min，冷却至20℃，移内容物于滴定瓶，用氢氧化钠标准溶液滴定至pH4.70。 3.7.结果计算
按式（1）计算脲酶活性U（mgN／min·g样品）：
（V0－V1）×14×T U＝ ……………………………………（1）
30×m
式中：V0 —— 空白试验所耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；
V1 —— 主体试验所耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL； T —— 氢氧化钠标准溶液的浓度，mol／L； M —— 试样的质量，g。
用式（2）换算其以干态基础计的脲酶活性Um：
U Um＝ ……………………（2）
1－M
式中：M —— 按照ZB X14 017测定的水分和挥发物的质量百分率。
3.8.允许差
同一实验室的双试验结果不得超过平均值的10％。
饲料脲酶活性的测定方法(定性)
1适用范围
适用于豆粕、膨化大豆粉. 2原理
尿素在脲酶的作用下,放出氨气,氨气溶于水中使得溶液pH上升,品红显红色. 3试剂
3.1结晶尿素
3.2酚红试剂:0.62g苯酚红溶于60mL酒精中,溶解后再加水至100mL,静置数天后使用,使用时要震荡. 4测定方法
取0.2g样品置于30mL试管中,加入0.02g结晶尿素,加入二滴酚红指示剂,加和20mL蒸馏水,振荡10秒钟,观察首先呈现红色于样品或溶液的时间. 5结果判定
1min内呈色者－活力很强 1～5min内呈色者-活力强 5～15min内呈色者-有点活力 15min以上呈色者-没有活力
10min内不呈现红色的大豆相关产品即认为合格
豆粕中蛋白质溶解度测定
蛋白质溶解度（PS）：鉴定豆粕过熟的方法是在0.2%的氢氧化钾溶液中测定豆粕的蛋白溶解度。因为高温使赖氨酸、胱氨酸、蛋氨酸及其他必须氨基酸发生美拉德反应（美拉德反应的产物呈现棕色，故又称棕色反应），因而降低了蛋白质溶解度。近年来，美国豆粕由于技术改进，蛋白溶解度有增高趋势。 1主要试剂
氢氧化钾（KOH）溶液：0.2%，pH为12.5。
称取3.360g氢氧化钾，置于1000mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。 其他试剂为凯氏定氮时所用的标准试剂。 2 测定步骤
称取经研细（60目）后的1.5g大豆（饼粕）粉于250mL烧杯中，加入75mL,0.2%KOH 溶液，在磁力搅拌器中搅拌20min。再将50mL液体转至离心管中，用每分钟2700r速 度离心10分钟。吸取上清液15mL，用凯氏定氮法测定其中的蛋白质含量。此含量相当 于0.3克原样本中溶解的蛋白质量。
3 蛋白质溶解度计算
蛋白质溶解度（PS）按下式计算：
PS（%）=(V-V0)*C*0.014*6.25/0.3*100%
式中：PS——蛋白质溶解度，%；
C——盐酸标准溶液浓度，mol/L；
V ——滴定试样时所需标准酸溶液体积（mL） V0 ——滴定空白时所需标准酸溶液体积（mL）； 结果分析
生大豆饼粕的PS可达到100%。日常分析中，当PS＞85%时，则认为大豆饼粕过 生，加热处理不足；而当PS＜75%时，则认为大豆饼粕过熟，加热处理过度；而PS在 75%～85%左右时，则认为大豆饼粕的质量较好。
粒度大小对蛋白质溶解度有影响，因此比较不同大豆饼（粕）样品时，要注意颗粒大小的可比性。