发布时间 : 星期日 文章ABI测序仪的测序原理和操作规程更新完毕开始阅读
心。
(2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中，稍离心。 (3) 在PCR仪上进行热变性(95℃ 2min)，冰中骤冷，待上机。
4．上机操作
按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kV预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2kV，20min)，在7.5kV下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。
5．仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。
6．测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。 【计算】
测序反应精确度计算公式：100%－差异碱基数(不包括N数)/650×100% 差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基，N为仪器不能辨读的碱基。 【注意事项与评价】
1．ABI PRISM 310基因分析仪是高档精密仪器，需专人操作、管理和维护。
2．本实验测序PCR反应的总体积是5μl，而且未加矿物油覆盖，所以PCR管盖的密封性很重要，除加完试剂后盖紧PCR管盖外，最好选用PE公司的PCR管。如PCR结束后PCR液小于4～4.5μl，则此PCR反应可能失败，不必进行纯化和上样。
3．作为测序用户来说，只需提供纯化好的DNA样品和引物，一个测序PCR反应使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR测序所需模板的量较少，一般PCR产物需30～90ng，单链DNA需50～100ng，双链DNA需200～500ng，DNA的纯度一般是A260nm/A280nm为1.6～2.0，最好用去离子水或三蒸水溶解DNA，不用TE缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/μl较好。 4．本实验使用的测序试剂盒是BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒，一般可测DNA长度为650bp左右。本仪器DNA测序精确度为(98.5±0.5) %，仪器不能辨读的碱基N＜2%，所需测定的长度超过了650bp，则需设计另外的引物。为保证测序更为准确，可设计反向引物对同一模板进行测序，相互印证。对于N碱基可进行人工核对，有时可以辨读出来。为提高测序的精确度，根据星号提示位置，可人工分析该处彩色图谱，对该处碱基作进一步核对。
一．Pump Block的清洁及维护
在机器运行前，必须确认Pump Block是干净的，使用POP-6测序时，注意POP-6室温下4天须更换。
1. 打开310主机，然后打开Macintosh微机， 打开Data Collection软件。
2. 在Instrument菜单下，选择manual control。
3. 选中syringe home，点execute执行。
4. 取下1ml玻璃注射器，去离子水洗净，晾干。
5. 松开capillary fitting，取下毛细管。
6. 取下buffer reservior
7. 双手执稳pump block，均匀用力，将其径直拔出。
8. 取5ml塑料注射器，用去离子水反复清洗pump block，特别注意管路的清洗。
9. 晾干后装上block，并装上毛细管。
二．安装毛细管，灌胶
1. 从4°C冰箱取出POP－6胶，室温回温30分钟。
2. 吸取少量 POP－6，将注射器来回抽动几次使胶浸润注射器内壁，然后将胶
排净。
3. 吸取POP－6适量（≈0.2ml），用DI H2O洗净注射器外壁，擦干，于Pump Block 右侧上紧。将胶放回4°C冰箱。
4. 重新装好毛细管。
5. 进入Manual Control菜单，关闭缓冲阀门(Buffer Valve Close)，松开废液阀门, 手指压注射器排净管道中气泡，关上阀门(Buffer Valve Close)。
6. 进入Manual Control菜单，打开缓冲阀门(Buffer Valve Open), 同样方法排净管道中气泡，然后关闭缓冲阀门。
7. 松开capillary fitting，排净毛细管一侧的气泡，关紧fitting，注意毛细管顶端位于管路十字架的右边缘。
8. 将毛细管固定于检测窗口holder处，注意毛细管窗口之清洁（可用无水乙醇清洗）, 毛细管窗口应与机器检测窗口位置的吻合（此点可用毛细管上的Marker位于检测窗边缘来证实）。
9. 毛细管另一端插入电极端，使尖端比电极略低约0.5mm，同时用手指轻轻左右调节毛细管,使之尖端贴近电极尖端(间隔约2毫米)，调好后用胶带固定，合