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ABI型DNA测序仪的测序原理和操作规程
DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。
【原理】 ABI PRISM
310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子
聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。
由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。
【试剂与器材】
1．BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。
2．pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2g/L，试剂盒配套试剂。
3．M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，试剂盒配套试剂。 4．DNA测序模板
可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2g/L，即200ng/μl。
5．引物
需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。
6．灭菌去离子水或三蒸水。
7．0.2ml或和0.5ml的PCR管 盖体分离，PE公司产品。
8．3mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8g NaAc?3H2O溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。 9．70%乙醇和无水乙醇。
10．NaAc/乙醇混合液 取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。
11．POP 6测序胶 ABI产品。 12．模板抑制试剂(TSR) ABI产品。 13．10×电泳缓冲液 ABI产品。
14．ABI PRISM 310型全自动DNA测序仪。 15．2400型或9600型PCR仪。 16．台式冷冻高速离心机。 17．台式高速离心机或袖珍离心机。 【操作步骤】 1．PCR测序反应
(1) 取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂： 所加试剂 测定模板管 标准对照管
BigDye Mix 1μl 1μl 待测的质粒DNA 1μl － pGEM-3Zf (+) 双链DNA － 1μl 待测DNA的正向引物 1μl － M13(-21)引物 － 1μl 灭菌去离子水 2μl 2μl
总反应体积5μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。
(2) 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃ 10s，50℃
5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。
2．醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物
(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP管中。
(2) 加入25μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。
(3) 加70%(V/V)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12 000r/min于4℃离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。
3．电泳前测序PCR产物的处理。
(1) 加入12μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离