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摘要：以实验室保存的枯草芽孢杆菌为出发菌株，利用NTG诱变及紫外线（UV）照射的方法，以获取可高效发酵生产蛋白酶的突变株。通过大量筛选及连续传代实验，确定了一株突变性状能稳定遗传的突变株，其蛋白酶产量较出发菌株有大幅度提高。 一、实验目的
（1）了解酸性蛋白酶高产菌株的筛选原理，初步掌握诱导酸性蛋白酶高产菌株和检测酸性蛋白酶高产菌株的方法；
（2）明确不同的诱变方法对应不同酸性蛋白酶高产能力； （3）学习鉴定和分析酸性蛋白酶高产菌株方法。 二、实验原理
蛋白酶是一类催化肽键水解的酶，在食品、皮革、洗涤剂等工业生产领域都有重要的应用。目前，微生物蛋白酶产生菌种主要来自于芽孢杆菌属细菌和链霉菌如灰色链霉菌、费氏链霉菌等)以及酵母。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是美国FDA公布的安全菌种 ，更是当今工业酶的主要生产菌种之一。目前，由其生产的酶占整个酶市场的50％，是工业上生产酶应用最广泛的菌种之一，主要用于生产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶。化学诱变剂亚硝基胍(NTG)是一种能与核酸碱基作用的双功能烷化剂，可与DNA分子的许多部位发生作用，使DNA分子增加了烷基侧链(烷化作用)，从而改变了DNA分子结构，同时还能在DNA双链间形成共价键，阻碍在DNA复制过程中双链的解开，从而引起突变。本研究以前期实验从自然界中分离筛选得到的野生优良枯草芽孢杆菌作为出发菌株进行NTG诱变选育实验，以期得到蛋白酶分泌能力显著提高的菌株。紫外线诱变紫外线诱变的机理是能作用于嘧啶，形成嘧啶二聚体（主要是TT），影响DNA正常解链与碱基配对，从而引起基因突变，提高酶产量。本实验以枯草芽孢杆菌为出发菌株，采用紫外线（UV）与亚硝基胍（NTG）分别诱变，筛选出蛋白酶高产菌株，该菌株产酶能力得到显著提高，进一步节约了成本，推进蛋白酶工业的发展。
三、技术路线
查阅文献确定研究方法 配制培养基 选取菌种 活化枯草芽孢杆菌菌种并分离纯化菌种 对菌种紫外线诱照射及亚硝基胍(NTG)进行诱变 得到不同条件下处理的菌落数 分析实验结果
四、实验的可行性
1.本实验所用的材料容易找到，且试剂在实验室都有； 2.实验步骤在实验室都可完成；
3.设有不同的诱变方法，形成对比，选出较好的诱变方法。 五、 材料、试剂、设备 1．材料：枯草芽孢杆菌
2．器材和仪器：摇床，恒温培养箱，离心机，高温灭菌锅，超净工作台、酒精灯，微量移液器，记号笔，培养皿，三角瓶，移液管，枪头，涂布棒。 3．试剂：
酪蛋白培养基 ：干酪素10g，水解酪蛋白lg，琼脂20g，将干酪素用0．5mol／L NaOH微热溶解，加蒸馏水至1000mL，调pH值为7．0，121℃灭菌30min。 六、方法与步骤
1. 菌悬液的制备：取已培养20 h 的活化枯草芽孢杆菌斜面一支，用10mL生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡10 min，以打碎菌
块，离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2次，最后制成菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。调整细胞浓度为108/mL。 2. 平板制作：将酪蛋白培养基熔化后，冷至45℃左右倒平板。 3.稀释：将菌悬液稀释为10-1～10-6/ml不同浓度的菌悬液。 4. 紫外线诱变处理
然后打开皿盖边搅拌边照射，剂量分别为1 min，2 min，3 min。可以累积照射，也可分别照射不同时间。所有操作必须在红灯下进行。 4.1 稀释涂平板
在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液各0.5 mL 进行不同程度的稀释。取最后3个稀释度的稀释液涂于酪蛋白培养基平板上，每个稀释度涂3 个平板，每个平板加稀释液0.1mL，用无菌玻璃刮棒涂匀，37℃培养 (用黑布包好平板)。注意在每个平板背后要标明处理时间、稀释度、组别、座位号。
4.2诱变效应
37℃培养20 h后，数出出菌落数，并计算致死率，之后用10％的盐酸溶液淹没平板，测量筛选培养基上菌落周围透明圈直径及菌落直径，计算出透明圈直径与菌落直径之比。
致死率（％）＝（A－B）/A×100%，
式中：A 为对照组平皿上的菌落数；B 为诱变处理后平皿上的菌落数． 5.亚硝基胍诱变处理
5.1 NTG诱变致死率曲线的测定
先分别取0.5mL 400ug/mL、600ug/mL、800ug/mL和l000ug/mL的NTG加入试管中，取已制备好的10-5或者10-6的菌悬液各0.5mL加入到上述试管中，混匀后立即置于28℃水浴保温30 min(处理浓度分别为200ug/mL、300ug/mL、400ug/mL和500ug/mL)用稀释法终止反应后，在暗处稀释涂酪蛋白培养基平板,28℃培养48 h；计算用不同浓度的NTG对菌种处理后所得的菌落个数。每组试验重复3次，取平均值。同时以同样操作，取未经NTG处理的菌稀释液涂平板作对照，根据对照平板上菌落数，依据下列公式计算出每个处理的致死率，绘制致死率曲线。致死率= (对照每毫升菌液中的活菌数一处理后每毫升菌液中的活菌数)／对照每毫升菌液中的活菌数。
6.枯草芽孢杆菌株诱变突变株筛选。根据致死率曲线，以致死率约为70％ ～80％的诱变剂量处理菌悬液，NTG处理后的枯草芽孢细胞适当稀释后涂布于酪蛋白培养基，37℃培养24 h，测量菌落的直径和透明圈直径，计算出透明圈直径与菌落直径之比，挑选产蛋白酶能力较强的菌株。 七、预期结果
1.紫外线诱变紫外线诱变的机理是能作用于嘧啶，形成嘧啶二聚体（主要是TT），影响DNA正常解链与碱基配对，从而引起基因突变，提高酶产量。菌株产酸性蛋白酶活力比出发菌株（CK）明显提高了。
2.通过初筛和NTG诱变筛选得到正突变枯草芽孢杆菌菌株，其透明圈与菌落直径比值较原始菌株的明显增大，说明突变株的产蛋白酶能力显著提高。菌株连续传代5次，其蛋白酶分泌能力基本稳定，说明NTG诱导的突变是可以遗传的。 八．小组讨论分析结果
九．相关依据
查阅不同的参考文献、期刊、书籍、对比实验的方法、原理、材料及仪器，根据实验室的相关设备等所设计。