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活性氧的检测及生理机制
摘 要 当植物所生长的外界环境如温度、湿度、土壤中的水分发生改变时植物体内会产生大量的活性氧，使作物遭到严重的损伤，即环境胁迫使植物体积累大量的活性氧，从而使植物严重损伤。在本文中主要介绍了活性氧的测定方法、生理机制及对环境胁迫所产生的影响进行了具体的阐述。
关键词 活性氧（ROS） 环境胁迫
1活性氧的定义
人类发现活性氧已有100年的历史了，在距离地球表面15—25公里的高空，因受太阳紫外线照射的缘故，形成了包围地球外围空间的活性氧层，这厚厚的活性氧层正是人类赖以生存的保护伞。活性氧又名三原子氧，因其类似鱼腥味的臭味而得名。其分子式为O3，是氧气的同素异形体，具有它自身的独特性质：在自然环境下，它是淡蓝色的气体；具有很强的氧化能力，是已知最强的氧化剂之一；正常情况下，极其不稳定，容易分解为氧气；在空气中的半衰期一般为20—50分钟，随温度与湿度的增高而加快。活性氧是一种强氧化剂，具有广泛杀灭微生物作用，包括细菌、芽胞、病毒、真菌等，其杀灭速度较氯快600—3000倍。 2活性氧的检测
活性氧本身具有多样性及不稳定性，这就为活性氧的检测增加了复杂性。通过研究，研究者们使用各种各样的方法和仪器去检测ROS在生物细胞内的影响， 反映了ROS在调节细胞行为的许多方面增加的证据支持一个中心的角色。其中的一些方法可以用于记录ROS和体内氧化损伤。早期的关于ROS在发育中扮演的角色的研究是基于具有氧化还原敏感性的发色体物质的使用，尽管一般的荧光探针在用于荧光检测的方法中广泛使用。大量的对于ROS水平敏感的ROS探针的一直在增加。在检测细胞ROS过程中，要考虑到探针对于检测过程中的ROS最佳特异性、保证细胞状态及荧光试剂的检测特异性。最广泛应用的荧光探针，应该是与一定范围内的ROS相反应而使其能够被检测得到，如果要检测某一种ROS，这种方法是不可行的。DCFH是目前应用最为广泛的荧光感受器检测ROS，用于在体外检测活性氧。DCFH是不具有荧光的，但是它可以被羟基、二氧化氮和过氧化氢等自由基氧化生成具有荧光的二氯荧光素（DCF）。尽管DCFH不是直接对过氧化物和超氧化物敏感，但是在目前的过氧化氢分解机制中，比如过渡金属离子和氧化物酶，基础的中间物质与DCFH反应产生DCF。由于产生的荧光物质可以被光所分解，因此在荧光检测的时候一定要严格控制检测条件。 3活性氧的生理机制[4]
ROS是生物体内的氧自由基，包括氧和含氧的高反应活性分子( 如超氧化物阴离子、组织过氧化物和自由基等)、作为细胞内和细胞间的第二信使ROS调节许多信号分子。ROS主要来源于线粒体，是线粒体由状态III向状态IV转换中高氧的环境和高还原态的呼吸链使大量电子漏出并还原氧分子而形成。Lewen 等［1］在小鼠缺血缺氧细胞模型中证实有ROS 的产生，ER腔内蛋白被氧化修饰，
因此ER可能是ROS攻击的重要目标之一。近有研究，ER上ROS的产生是通过NADH －细胞色素P450 还原酶将电子传递给O2 形成阴离子，在NADH的辅助下，核膜上的电子传递链将电子传递给O2，便产生了ROS，ROS的产生与清除之间的平衡对维持细胞的氧化还原状态非常重要，细胞内氧化还原状态的改变促进了氧自由基的产生和凋亡诱导因子的激活，致使细胞凋亡的同时又加剧了细胞内氧化还原状态的改变，进而影响细胞的生理状态，启动了氧化应激，触发细胞凋亡信号的激活。内质网的主要功能就是通过折叠酶和分子伴侣的作用使新合成的蛋白达到正确的折叠构象并有效的进入分泌途径，为蛋白的折叠提供一个独特的氧化环境生理情况下，介导UPR产生的3个ERS感受蛋白PERK ATF6 IRE1，分别与 ER分子伴侣GRP78(glucose- regulated protein78)结合处于无活性状态ROS可以直接攻击维持蛋白折叠酶活性所必须的游离巯基，使得ER腔内蛋白质被氧化修饰，进而诱导ER折叠酶或分子伴侣的功能异常而引起未折叠蛋白的积累，并滞留于ER腔内触发了ERS，与此同时ERS标志性分子伴侣蛋白GRP78的表达明显增加并从3种跨膜蛋白上解离，转而去结合未折叠蛋白，以增强ER蛋白质折叠能力，减少蛋白质在ER的堆积与GRP78解离后的ERS感受蛋白随之被激活进而触发了UPR的产生，并通过限制非折叠蛋白的合成，加强ER对蛋白的折叠能力，加速非折叠蛋白的降解等方式减轻了ER的负荷压力，触发了其各自诱导的促生存响应。 4环境胁迫对活性氧的影响
环境胁迫使植物细胞中积累大量的活性氧。从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促两类酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、 过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX) 等。非酶类抗氧化剂包括抗坏血酸 、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。利用基因工程策略增加这些物质在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物。 4.1活性氧造成的氧化损伤
当环境胁迫长期作用于植株，使其产生的活性氧超出活性氧清除系统的能力所及时就会产生氧化损伤。活性氧可以攻击蛋白质的氨基酸残基，尤其是Tyr、 Phe 、Trp 、Met和Cys。形成羰基衍生物[2]此外，活性氧可以促进分子内和分子间的交联如二硫键的形成和蛋白质的断裂，超氧化物可使一些古金属的酶类失活，或产生羟自由基，引发磷脂的过氧化。1umo l／L的双氧水可以抑制碳固定。在lumol／L 的低浓度下。它可使卡尔文循环中的一些巯基酶类失活最主要的是双氧水能够通过相应的反应产生更活跃、更有毒性OH，从而导致膜脂过氧化、碱基突变、DNA链的断裂和蛋白质的损伤。[1]氢氧根修饰一些蛋白质使它们对蛋白水解酶的作用更敏感，一旦被破坏，蛋白质就会进一步被肽链内切酶阵解，已发现在类囊体的膜上存在这样的酶此外，一种具有多种催化功能的蛋白酶复合体已在哺乳动物和植物中被证实其具有选择性地降解活性氧所破坏的蛋白质。
4.2活性氧的积极作用
虽然活性氧对植物细胞有很强的毒害作用，但在有些代谢过程中它却能被有效利用；① 当病原体侵染植物后，细胞内的活性氧水平迅速提高，从而导致过敏细胞死亡：②活性氧参与细胞壁中富含羟脯酸的糖蛋白交联过程，这也有利于抵御病原体侵入细胞 ③活性氧很可能作为第二信使调控抗病相关基因的表达并启动植物抗毒素合成基因的转录。[3]
4.3活性氧的酶促脱毒系统 4.3.1超氧化物歧化酶
SOD为植物抗氧化系统的第一道防线。清除细胞中多余的超氧根阴离子。在高等植物中SOD根据其辅基部位结合的不同金属离子分为3类：Mn-SOD、Fe-SOD、Cu／Zn –SOD。[3]SOD基因家族的深入研究是在玉米中进行的。已得到的序列分析表明，广泛存在于真核生物中的Cu／Zn -SOD与Fe-SOD、Mn –SOD不同源。
4.3.2抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化氢酶
APX是清除H2O2的主要酶类。根据其在植物细胞中的定位分为4类：类囊体APX、基质APX、微体APX和细胞质APX。过氧化氢酶主要存在于植物过氧化物酶体与乙醛酸循环体中，它与APX一样都是清除H2O2的主要酶类。 4.4活性氧的非酶促清除及相关分子[5]
非酶促清除机制具有一些形态学特征。如：植物表面及叶部具有蜡质、 产生非光化学抑制过程，如紫黄质和玉米黄质循环及光呼吸等。非酶类抗氧化剂包括类黄酮、生育酚、抗坏血酸、谷胱甘肽、胡萝卜素和甘露醇。这些物质既可直接同 ROS反应，将其还原；又可作为酶的底物在ROS的清除中发挥重要作用。 4.4.1抗坏血酸和谷胱甘肽
抗坏血酸和谷胱甘肽在活性氧脱毒过程中起重要作用，它们可直接同ROS反应 ，将其还原，又可作为酶的底物在活性氧的清除过程中扮演重要角色。抗坏血酸、 还原型谷胱甘肽及APX、GR、SOD和MDHAR都参与了植物细胞中抗氧化剂的再生过程。 4.4.2甘露醇和类黄酮
甘露醇是已知的氢氧根离子清除剂。在氧化胁迫下，甘露醇可以保护巯基酶类或其他巯基调控的叶绿体组分，如黄素蛋白、硫氧还原蛋白和谷胱甘肽。最近研究发现类黄酮与抗坏血酸和a-生育酚一样，是主要的活性氧清除剂。 5提高植物抗氧化能力的基因工程
现已证实增强植物耐逆性的途径之一是提高植物体内抗氧化酶类活性及增强抗氧化代谢的水平。利用基因工程手段获得高效表达的转基植株，为了研究抗 氧化酶类在清除活性氧方面的功能及作用提供了可行途径。清除活性氧的重要性已在几种酶类的转基因植株中得到证实，转基植株中SOD、APX、GR和过氧化氢酶的过量表达提高了植株对氧化胁迫的抗性。植物中许多抗氧化剂参与活性氧的清除过程，而且在氧化胁迫下许多细胞组分需要保护，所以单纯地转化某一个基因使之过量表达很难达到预期的效果。为改变耐受胁迫体系中的多个组分就必需 采取多基因克隆策略。[5]如：(1)靶基因克隆，如几种细胞组分中的活性氧清除酶类；(2)组装能够吸钾排钠的基因表达框架；(3)产生能够自发满足离子均衡、碳的分配及蛋白质保护的转基因组； (4)产生具有细胞组织器官和点育特异性的转基因组。 6存在的问题
目前仍需解决的问题是弄清植物在胁迫条件下，具有防御功能的基因的表达及表达产物的代谢与信号传导途径，及在哪一发育阶段胁迫保护是必需的。解决这一任务需要寻求新的策略。如：①将多个基因转化到模式生物酵母菌拟南芥、烟草和水稻巾。测定基因的表达及表达产物的代谢情况②重点进行代谢调控分析第一种策略是在合适的启动子元件调控下转移所有与增加胁迫耐受性有关的基因；通过第二种速径，我们能够在植物原有代谢的基础上衡量提高植物耐受性的
酶类或代谢逮径的重要性。 7展望
ERS与细胞凋亡及肿瘤的发生发展都密切相关ERS引起的细胞凋亡不同于线粒体介导的细胞凋亡，有一套自身的信号传递通路，称为ER相关性死亡( ER- associated death，ERAD)途径而且参与ERS的分子伴侣和感受蛋白是ERS特异诱导的，因此它们能够作为治疗肿瘤的有效靶点ROS作为ERS的上游信号，研究两者之间的内在联系及其作用机制，可使我们进一步了解肿瘤细胞凋亡机制与ROS之间的联系，为开发治疗肿瘤疾病的化疗药物提供新的思路而ERS诱导的细胞凋亡是一类新的凋亡途径，ERS介导的细胞凋亡与其他途径的凋亡有着密切的联系，其反应机制涉及UPR Ca2 +的平衡以及氧化应激等机制，许多方面仍未确定，因此需要进一步研究，为肿瘤治疗提供新的途径。 参考文献
[1] Lewen A， Matz P， Chan P H． Free radical pathways in CNS injury
［J］． Neurotrauma， 2000， 17: 871 － 90．
[2] Stadtman E R，Protein Oxidation and amttg． Science，1992，2S7：1220～
1224。
[3] nze D.Van Montagu M,Uxidative in plants .Curr Opin Biotechof.1995,6：
153～158.
[4] 周映彤.中国药理学通报，2011,5：597-600. [5] 杜秀敏.生物工程学报，2001,17（2）：121-124.