发布时间 : 星期一 文章刘耀光 - 多靶点pCRISPR载体（单子叶和双子叶植物用）使用方法2015-4-14(new)(1)更新完毕开始阅读
3 cassettes: Pps-GGL/Pgs-GG2, Pps-GG2/Pgs-GG3, Pps-GG3/Pgs-GGR;
扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA, U#-T3-gRNA;
4 cassettes: Pps-GGL/Pgs-GG2, Pps-GG2/Pgs-GG3, Pps-GG3/Pgs-GG4, Pps-GG4/Pgs-GGR;
扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA, U#-T3-gRNA, U#-T4-gRNA
5个或以上靶点：如此类推。
4.5靶标sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体的连接方法
本载体系统可采用Golden Gate cloning (Engler et al., 2008; 2009), Gibson assembly方法(Gibson, et al., 2009, 2010) 2种策略组装Cas9载体和多个gRNA表达盒片段。
Golden Gate ligation是利用Bsa I (type IIs restriction enzyme)的识别位点和切割位点不重叠的特性，可以设计出多种不同的且非回文结构的粘性末端（256-16=240种，减去的16种是回文结构；第6-7页的PCR扩增引物使用了16种）。多个要连接的片段在连接点具有特异的互补末端可以连接（如图6, 4个表达盒为例)，而非连接点的末端之间不互补不能连接（相同末端分子间也不互补不能连接），因此连接反应是向着目标单方向进行，效率很高。由于OsU6a-LacZ (AtU3b-LacZ) 附有LacZ标记基因(198 bp)，可在含有X-gal的培养基产生蓝色菌斑筛选阳性克隆。
SpeIBsaIMluIPB-LGolden Gate cloningT1ctcggagcOsU6a(B-L)LacZctgagactOsU6bT2aagattctOsU6cT3gactctgaOsU3T4MluI(B-R)cggtgccaPB-RBsaIFigure 6. Generation of a 4-target construct by Golden Gate cloning
注：由引物Pps-GGL导入载体的唯一Spe I位点是特别留的一个“后门”。其用途是，在构建好一组目的靶点sgRNA
表达盒的载体的基础上，如果情况需要再添加第二组其它靶点sgRNA表达盒，可以用Spe I将载体切成线状，再用Gibson Assembly将第二组靶点sgRNA表达盒克隆进去。如果连接较多（4个或以上）的sgRNA表达盒的
效率低（转化不能获得阳性克隆），就以连接产物为模板，以引物PB-L/PB-R (见Table S1)扩增出连接的多个表达盒，再次与pYLCRISPR/Cas9载体酶切连接。
5. 载体构建操作方法：
靶点设计，接头引物合成（sgRNA方法2）（sgRNA方法1）sgRNA质粒先切后连sgRNA质粒sgRNA质粒BsaI酶切sgRNA表达盒连接物连接第一轮PCR(每种2反应)扩增产物(混合)Golden Gate引物第二轮PCRGibson Assembly引物gRNA表达盒gRNA表达盒BsaI 切pYLCRISPR/Cas9质粒Golden Gate 连接（边切边连）Gibson Assembly连接转化阳性菌落(蓝色），PCR确认，MluI酶切，测序Figure 7. Working flowchart for preparation of multi-target CRISPR/Cas9 constructs
（1）菌种活化和质粒提取制备：将pYLCRISPR/Cas9菌种(TOP10F’)和CRISPR/sgRNA vectors菌种(DH10B)
分别在含有卡那霉素（25 μg/ml）和氨苄青霉素（50μg/ml）平板培养基划线培养过夜，挑取单菌落培养1ml种子液，再扩大培养用于提取质粒。用2-3U Bsa I试切~150ng质粒(10μl)，电泳检查（未切的80ng质粒为对照）。 注：不要将保存的菌种直接接种！
关键点：pYLCRISPR/Cas9载体较大（约15~16.5 kb），拷贝数较低（pBR322复制子），用质粒小型柱提取
纯化的回收率较低，因此最好用适合于较大质粒提取的大柱纯化试剂盒（如TIANGEN公司EndoFree Maxi Plasmid Kit）提取纯化（由于溶出的质粒DNA可能含有残留的洗液成分即乙醇，且体积大浓度低，最好再做一次标准的乙醇沉淀操作以去除残留乙醇和减少DNA溶液体积），或用普通碱裂解法提取（用酚/氯仿抽提2次后再乙醇沉淀）。溶解在TE（约0.5g/l）保存。取部分质粒稀释成约100 ng/l冷冻保存，作为步骤（10）使用。
关键点：由于接下来要用到的Bsa I是很容易失活的酶，有时新买的Bsa I也是失活的！在进行以下步骤之
前，先检测Bsa I活性：配制10 μl Bsa I反应液，含有5 U Bsa I, ~100 ng pYLgRNA-U#(或其它有AmpR基因的质粒)。37℃反应15min后电泳检查，以未切的相同质粒为对照。pYLgRNA-U#的Bsa I图谱见Figure 3。为了尽可能保持酶活性，最好把Bsa I分装成几管冷冻保存。NEB公司的Bsa I-HF经过
修饰以降低星活性，推荐使用NEB BsaI-HF和配套的CutSmart Buffer。
? sgRNA表达盒构建方法1:
（2）靶点接头制备：将接头引物TE溶解成100 μM母液，各取1 μl加入到98 μl 0.5x TE混合稀释到1 μM。
约90℃ 30 s，移至室温冷却完成退火。
（3）sgRNA载体酶切：取pYLgRNA-OsU3/LacZ等质粒各1 μg，在25 μl反应用10 U Bsa I酶切20min，冷冻保存。
关键点：不要用太多酶和太长时间过度酶切！
（4）sgRNA表达盒连接反应：酶切过的pYLgRNA-OsU3/LacZ等质粒与各所对应接头连接反应： 成分
10×T4 DNA ligase Buffer pYLsgRNA-U#质粒 接头
T4 DNA ligase(Takara) ddH2O
加入量 1 μl 0.5 μl 0.5μl 0.05 μl
补足到 10 μl
终浓度(量) 1×
10~20 ng 0.05 μM ~18 U
室温（20-28℃）连接约10-15 min
关键点：过多DNA ligase和过长时间连接会产生较多第6页所述产物IV &V。
注：不同公司的T4 DNA ligase单位的定义和标定单位不同，如Takara的350U/μl，NEB的400 U/μl，但绝对活性单位/μl都接近，即每10~15 μl反应大致使用0.05~0.1 μl酶。
上述步骤（3），（4）酶切和连接二步反应可用一步酶切-连接反应（边切边连法）替代：
配制10 μl 1x Bsa I酶切连接（Restriction-ligation）反应液：在1x Bsa I-酶切Buffer中加入ATP至终浓度0.5~1.0 mM（此buffer对Bsa I和ligase都有效），加入约10~20 ng pYLgRNA-U#质粒（预先配好20 ng/μl保存），0.5 μl接头（最终浓度0.05 μM），3~5 U Bsa I，~15 U T4 DNA ligase。如果实验室没有ATP，在1x内切酶Buffer中加入0.5-1.0 μl 10 x NEB T4 DNA ligase buffer（10x NEB T4 DNA ligase buffer中含有10 mM ATP, 但10x Takara T4 DNA ligase buffer中含有1.0 mM ATP，因此优先用NEB的）。注意：没有加内切酶buffer而单纯加T4 DNA ligase buffer缺少KCl或NaCl，不适合Bsa I酶切！）。用变温循环仪（或PCR仪）循环反应5循环：37℃ 5 min，20℃ 5 min。
（5）第一轮扩增：每个sgRNA表达盒分为2个PCR反应，各15 μl反应体系：取0.5 μl连接产物为模板，使用第6页引物U-F/接头反向引物（反应1），和接头正向引物/gR-R（反应2），各0.2μM,适量高保真PCR酶。25-28循环：94℃ 10s，60℃ 15s ，68 ℃ 20 s。(任意) 取4 μl电泳检查（反应2产物长度约140 bp，用2%琼脂糖胶）。如果扩增产物较弱，也可以继续第二轮PCR。
注：虽然用第二轮PCR的位置特异引物直接从连接产物也可以扩增出目标产物，但用2轮PCR扩增可以更稳定地得到特异性目标产物且能避免空载产物扩增，见Figure 4。
关键点：最好使用KOD-Plus (TOYOBO)，保真度最高且性价比高，或KOD FX。不要使用能在产物3’附加A碱基的DNA聚合酶，此A碱基使产物在第二轮PCR中不与互补链配对而不能延伸补平）。
（6）第二轮PCR：
按附录1通用引物所述，预先将位置特异引物对混合成10×工作液，每种1.5 μM： 引物组合
1个靶点：PT1R；
2个靶点：PT1，PT2R； 3个靶点：PT1，PT2，PT3R;
4个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4R;
5个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5R;
6个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6R；
7个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7R； 8个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7，PT8R
取第一轮PCR产物1 μl用H2O稀释10倍，各取1 μl混合为模板。各表达盒20-50 μl PCR (1个靶点50 μl； 2-3个靶点各30 μl；4个或以上靶点各20 μl)。加入1/10量每种引物组合工作液（最终浓度0.15 μM）。使用适量KOD-Plus或其它高保真PCR酶。
扩增17-20循环(实际情况调整)：95 ℃ 10s，58℃ 15s，68 ℃20 s。 取2 -3 μl电泳检查产物长度是否符合（注1），并估计样品的大致浓度。
注1：各种启动子gRNA表达盒的长度为（括号为Bsa I切后）：
单子叶表达盒
PCR扩增产物长度（bp）
BsaI酶切后长长度（bp）
双子叶表达盒
PCR扩增产物长度（bp）
BsaI酶切后长度（bp）
LacZ-OsU6a-gRNA OsU6a-gRNA OsU6b-gRNA OsU6b-gRNA LacZ-OsU3-gRNA OsU3-gRNA
831 629 515 924 766 603
801 599 485 894 736 573
LacZ-AtU3d-gRNA AtU3d-gRNA LacZ-AtU3b-gRNA AtU3b-gRNA AtU6-1-gRNA AtU6-29-gRNA
486 284 709 507 487 502
456 254 679 477 457 472
（7）根据各样品产物估算的量，把所有产物大致等量混合，酚抽提乙醇沉淀或用PCR产物纯化kit纯化。 关键点：此步骤是为了除去DNA聚合酶，以防止下面步骤Bsa I酶切产生的粘性末端被补平。
? sgRNA表达盒构建方法2 (Overlapping PCR):
（8）取2-5 ng pYLgRNA-OsU#质粒为模板，在一个反应中使用4种引物：U-F和gRT#+ 各0.2 μM，U#T#-和gRT#+（Table S1）各0.1 μM。25-28 循环：94 ℃ 10s，58℃ 15s ，68 ℃ 20 s。 在扩增过程中，开头的若干循环时U-F/U#T#-扩出U#--T#序列，gR-R/gRT#+扩出T#--sgRNA序列。后期的循环中通过overlapping PCR产生2个片段合并的sgRNA表达盒片段。
(9) 取第一轮PCR产物1μl用H2O稀释10倍，取1 μl为模板，按以上步骤（6）进行第二轮PCR。
? 组装sgRNA表达盒到pYLCRISPR/Cas9载体 (策略I, Golden Gate cloning)：
(10) 酶切-连接反应