发布时间 : 星期四 文章03 第3章 氨基酸和蛋白质更新完毕开始阅读
和度Y是0.25，大量释放氧，氧的释放量△Y是0.72。肌肉毛细血管中的肌红蛋白的P50=2 torr，可以高度结合血红蛋白释放的氧。
例题3-5：分离纯化蛋白质的一般原则是什么?
解：在分离纯化某一个特定蛋白质时，通常要求在尽量保持蛋白质的天然构象和活性的同时，提高蛋白质的纯度、均一性和回收率，一般可以分为以下几步。
（1）前处理 用各种方法将细胞破碎，使蛋白质从组织或细胞中释放到提取液中，用过滤或离心法除去细胞碎片。动物组织和细胞可以用电动捣碎机、匀浆器或超声波破碎机处理。植物组织和细胞可以用石英砂与提取液一起研磨，或用纤维素酶处理。细菌细的胞壁可以用超声波破碎机处理，与石英砂研磨或用溶菌酶处理。
（2）粗分级分离 前处理得到的蛋白质溶液中含有大量的杂蛋白以及少量的核酸和多糖，可以选用适当的方法，去除杂蛋白。一般可以采用盐析、等电点沉淀或有机溶液沉淀等方法。
（3）细分级分离 粗分级分离步骤已经将大部分杂蛋白除掉，细分级分离可以将样品进一步纯化。一般用凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等方法。又是还可以采用各种电泳方法。
（4）结晶 这是分离纯化的最后一步，结晶和重结晶可以进一步纯化蛋白质。蛋白质的结晶不仅是纯度标志，还表明蛋白质处于天然状态，没有发生变性。
例题3-6：凝胶过滤层析与凝胶电泳中的分子筛效应有什么不同？为什么？
解：这两种分离方法的原理不同。在凝胶过滤层析中，分子量大的蛋白质不能进入凝胶孔隙内部，只能穿过凝胶颗粒之间的间隙，很快流出层析柱。因此，分子量大的蛋白质，移动的路径短，移动速度较快；分子量小的蛋白质，移动的路径长，移动速度较慢。而在凝胶电泳中，整个凝胶是一个完整的空间网状结构，分子量大的蛋白质与分子量小的蛋白质都必须穿过凝胶，移动的路径是相同的。分子量大的蛋白质在胶孔中的摩擦力较大，移动速度较慢，分子量小的蛋白质在胶孔中的摩擦力较小，移动速度较快。
例题3-7：什么是蛋白质的变性作用？引起蛋白质变性的因素有哪些?
解：蛋白质的变性作用，是指蛋白质高级结构被破坏。蛋白质的天然构象解体，多肽链由有序状态成为伸展松散的无规则状态。变性作用一般不涉及肽键的断裂，而主要是次级键断裂。变性后的蛋白质，溶解度降低，粘度增加，失去生物活性，失去结晶能力，易被蛋白酶水解。
引起蛋白质变性的因素有两大类：物理因素：高温、高压、紫外线、超声波。化学因素：强酸、强碱、重金属、变性剂。
例题3-8：蛋白质化学研究中常用的试剂有：溴化氰，尿素，?巯基乙醇，胰蛋白酶，过甲酸，丹磺酰氯，6 mol/L盐酸，茚三酮，异硫氰酸苯酯，和胰凝乳蛋白酶。为完成下列各项实验，请选择最合适的试剂。
A.一个小肽的氨基酸序列测定
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B.多肽的N末端氨基酸测定
C.一个不含二硫键的蛋白质的可逆变性 D.芳香族氨基酸残基的羧一侧肽键的水解 E.甲硫氨酸的羧基一侧肽键的裂解 F.通过氧化途径将二硫键打开
解：A. 小肽的氨基酸序列测定用异硫氰酸苯酯 B. 多肽的N末端氨基酸测定用丹磺酰氯 C. 不含二硫键的蛋白质的可逆变性用尿素
D. 芳香族氨基酸残基的羧一侧肽键的水解用胰凝乳蛋白酶 E. 甲硫氨酸的羧基一侧肽键的裂解用溴化氰 F. 通过氧化途径将二硫键打开用过甲酸
例题3-9：多聚谷氨酸在pH3.0以下的水溶液中形成α－螺旋，而在pH5.0以上的水溶液中却为伸展状态，试解释这个现象。在什么pH条件下，多聚赖氨酸会形成α－螺旋？
解：氨基酸侧链基团的解离性质对α－螺旋的形成有很大的影响。由单一一种氨基酸构成的聚合物，只有当侧链基团不带电荷时才能形成α－螺旋。因为相邻残基的侧链上带有同种电荷会产生静电排斥力，阻止α－螺旋的形成。谷氨酸侧链的pKa为4.1，在pH3.0以下的水溶液中多聚谷氨酸侧链几乎不带电荷，能够形成α－螺旋。在pH5.0以上的水溶液中，多聚谷氨酸侧链几乎全部带负电荷，不能形成α－螺旋，呈现伸展状态。
赖氨酸侧链的pKa为10.5，当pH远高于10.5时，多聚赖氨酸的侧链不带电荷，可以形成α－螺旋。当pH远低于10.5时，多聚赖氨酸的侧链带正电荷，呈现伸展状态。
例题3-10：试解释下列现象。用热水洗涤羊毛衫时，羊毛衫会变长，但是在电热干燥器内干燥时，羊毛衫又会收缩。而丝绸制品经过同样的处理却不收缩。
解：羊毛纤维的多肽链的基本结构单位是α－螺旋，每个氨基酸残基沿α－螺旋的轴向长度是0.15nm。在加热条件下，纤维中的部分α－螺旋转化为β－折叠构象。β－折叠中每个氨基酸残基的轴向长度是0.65－0.7nm，所以羊毛纤维伸展变长。当干燥以后，多肽链又由β－折叠构象转变为α－螺旋构象，羊毛纤维收缩。
丝绸纤维中主要是丝心蛋白，多肽链由β－折叠构象组成，在加热条件下不会发生α－螺旋构象与β－折叠构象之间的转化，因此丝绸纤维在热水洗涤和干燥时基本不会出现伸展和收缩现象。
例题3-11：有一蛋白质，在某组织内含量较低，很难分离提纯，现已知其分子量，并从其它实验室要来该蛋白质的抗体，问用哪些实验方法可以初步证实组织内的确含有该蛋白质?
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解：先用根据这种蛋白质的分子量，选用一定浓度的聚丙烯酰胺作用分离胶，用SDS-PAGE分离从该组织中所提取得到的蛋白质。然后，用蛋白质印迹技术，转移到特定类型的薄膜上，最后用酶联抗体进行检测，观察一种分子量的蛋白质条带是否呈阳性反应。如果呈阳性反应，则初步证实组织内的确含有该蛋白质。
例题3-12：假定蛋白质是在pH7.0低离子强度的溶液中,下述蛋白质的哪些氨基酸残基能形成:(1)α螺旋；(2)β折叠；(3)无规则卷曲；(4)二硫键。
Ile-Cys-Pro-Val-G1n-His-Tyr-Thr-A1a-Phe- Cys-Trp-Leu-Met-Pro-C1y-G1y-Hypro-Phe- Gly-
5 10 15 20 Ala-Gly-Ala-G1y-Ser-Gly-Ala-Gly-Ile-Glu- Asn-Glu-Gln-Asn-Met-Ala-His-Phe-Trp- Tyr-
25 30 35 40 LYs-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Cys-Glu-Ile-Gly- Ser-G1y-Ser-Gly-Ala-G1y-Ser-G1y-Arg- Arg-
45 50 55 60
Lys-Gly-Arg-Gly-Arg-Pto-Hypro
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解：(1)α螺旋：4～14，29～40
(2)β折叠：20-28和58-50形成反平行的β折叠。 (3)无规卷曲：15～19，41～49(带电荷的残基)，59～65。 (4)二硫键：2位或11位的Cys可以和47位Cys形成二硫键。 例题3-13：根据以下实验结果推断一多肽链的氨基酸序列。 (1)酸水解和氨基酸组成为Ala2，Arg，Lys2，Met，Phe，Ser2。
(2)羧肽酶A水解得一氨基酸为Ala。
(3)胰蛋白酶水解得四个肽段，其氨基酸组成如下： ①Ala，Arg ②Lys，Phe，Ser ③Lys ④Ala，Met，Ser。 (4)溴化氰水解得两个肽段，其氨基酸组成如下：
①Ala，Arg，Lys2，Met，Phe，Ser②Ala，Ser。 (5)嗜热菌蛋白酶水解得两个肽段，其氨基酸组成如下： ①Ala, Arg, Ser ②Ala,Lys2,Met, Phe, Ser。 解：从(1)可知该肽为九肽。 从(2)可知其C端为Ala。
从(2)(3)和胰蛋白酶的专一性可知如下肽段： (A)Ala-Arg (B)(Phe，Ser)-Lys (C)Lys (D)(Met，Set)-Ala 从(4)和(2)可知：(E)…Met-Ser-Ala
从(5)和嗜热菌蛋白酶的专一性可知：(F)…Phe-(Ala，Lys2，Met，Ser) 从(E)和(F)可知：(G)…Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala
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从(A)(B)(G)可知该肽的氨基酸序列为Ala-Arg-Ser-Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala
例题3-14：有三种未知的蛋白质A、B、C。一种蛋白质主要是α螺旋构象。另一种主要是β折叠构象。还有一种是三股螺旋的胶原蛋白。用氨基酸分析仪测定了每种蛋白质的氨基酸组成。结果如表3—1所示，你能指出哪种蛋白质相应于哪种构象吗?为什么?
表3-1 三种蛋白质的氨基酸组成（摩尔百分数）
蛋白质 Ala Arg Asp Cys Glu Gly His Hypro Ile
解：蛋白质A中含小侧链的氨基酸多，Gly、Ala和Ser共占86.2％，所以蛋白质A是丝蛋白，是β折叠构象。蛋白质B中半胱氨酸的含量高，占11.2％，所以蛋白质B是羊毛纤维，是Q螺旋构象。蛋白质C中，Gly占33％，Pro占12.2％，Hypro占9.4％，所以蛋白质C是三股螺旋的胶原蛋白。 例题3-15：什么是别构效应(变构效应)?
解： 别构效应是指生物体内具有多个亚基的蛋白质与变构效应剂结合后而引起其构象的改变，从而蛋白质分子改变生物活性大小的现象称为别构效应。别构效应是生物体代谢调节的重要方式之一。 例如：血红蛋白分子是由四个亚基(α2β2)组成的蛋白质。脱氧血红蛋白分子由于分子内形成了八对盐键，使分子的构象受到约束，构象稳定，和氧的亲和力较弱。当一个α-亚基与O2结合后，部分盐键被破坏，某些氨基酸残基发生位移，这时与氧的结合位点随即暴露出来，使第二个α-亚基构象改变，对氧的亲和力增加而与氧结合。这样又可以使两个β-亚基依次发生构象改变而以更高的亲和力与氧结合。这时八对盐键已经全部断裂，α1β2和α2β1之间的位移也达到7埃。血红蛋白分子的变构作用使得整个分子以很快的速度与全部四个氧分子完全结合，从而提高血红蛋白分子的携氧的功能。
例题3-16：在体外，用下列方法处理对血红蛋白与氧的亲和力有什么影响? (1)pH从7.0增加到7.4。
(2)CO2分压从10torr增加到40torr。 (3)O2分压从60torr下降到20torr。
(4)2.3-二磷酸甘油酸的浓度从8×10mol/L下降到2×10mol/L。
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-4
A 29.4 0.5 1.3 - 1.0 44.6 0.2 - 0.7
B 5.0 7.2 6.0 11.2 12.1 8.1 0.7 - 2.8
C 10.7 5.0 4.5 - 7.1 33.0 0.4 9.4 0.9
蛋白质 Leu Lys Met Phe Pro Ser Trp Tyr Val
A 0.5 0.3 - 0.5 0.3 12.2 0.2 5.2 2.2
B 6.9 2.3 0.5 2.5 7.5 10.2 1.2 4.5 5.1
C 2.4 3.4 0.8 1.2 12.2 4.3 - 0.4 2.3
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