发布时间 : 星期五 文章03 第3章 氨基酸和蛋白质更新完毕开始阅读
胞贫血病。正常人血红蛋白，β6是Glu，镰刀状细胞贫血的患者的血红蛋白β6是Val。在生理条件下，Va1不带电荷，疏水，Glu带负电荷，亲水。
3．免疫球蛋白的结构特点和功能
⑴．抗原与抗体 抗原是指进入异体机体后，能致敏淋巴细胞产生特异抗体，并能与抗体发生特异结合的物质，主要有蛋白质、核酸以及其它高分子化合物。抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白，它是能与相应抗原特异性结合并产生免疫反应的球状蛋白质，称免疫球蛋白。抗体具有高度特异性和多样性，人类能够产生超过10种的抗体。
⑵. 免疫球蛋白的结构特点 IgG分子由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，四条肽链间有二硫键连接。重链的分子量为53000左右，轻链的分子量为22000左右。重链和轻链各分两个区域，重链N?端1?4为可变区，C?端3?4为恒定区，轻链N?端1?2为可变区，C?端1?2为恒定区。重链的可变区和轻链的可变区共同组成一个抗原结合部位。
⑶. 抗体－抗原反应 以IgG为例，一个IgG分子含有2个抗原结合部位，它们位于Y形结构的2个臂的顶端。如果抗原分子含有2个抗原决定簇，抗体可以形成抗原－抗体的交联晶格，产生沉淀反应。抗原抗体反应的条件：抗原决定簇与抗体结合部位构象互补，抗原与抗体有对应的化学基团，通过作用力（离子键、氢键）使二者结合。抗原抗体反应可以广泛用于生物化学分析，例如免疫扩散，免疫电泳，酶联免疫分析和Western印迹。 （六）蛋白质的性质及其应用
1．蛋白质的两性性质
蛋白质分子中，侧链上各种可解离基团以及末端的?－氨基和?－羧基的解离性质，决定了蛋白质所带电荷的性质和数量。在溶液中，当某种蛋白质所带的净电荷为零时，对应的pH值称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸的残基数与碱性氨基酸的残基数之比有关系。酸性氨基酸残基的含量越高，等电点越低；碱性氨基酸残基的含量越高，等电点越高。在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度、粘度均为最小值。
2．蛋白质的变性与复性
某些物理或化学因素（高温、高压、紫外线和表面张力、强酸、强碱、有机溶剂、脲和胍）能破坏蛋白质分子的次级键，使得蛋白质的天然构象解体，但一级结构不变。蛋白质变性的后果是生物活性丧失，侧链基团外露，物理、化学性质改变，生物化学性质改变。蛋白质的复性是指当变性因素除去以后，变性的蛋白质又可以重新回复到原来的天然构象。蛋白质的复性实验证明，蛋白质的一级结构决定蛋白质的高级结构。
3．凝胶过滤法测定蛋白质相对分子量的原理
不同大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶颗粒的网状结构中，被排阻在颗粒之外，通过颗粒之间的间隙快速流出层析柱。比凝胶孔径小的分子能不同程度地进入凝胶颗粒的网状结
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构中，因此不同大小的蛋白质分子在层析柱中移动的路径不同，分子量大的蛋白质先流出柱子，分子量小的蛋白质后流出柱子。
4．SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量的原理
SDS是强变性剂，能破坏蛋白质分子中的氢键和疏水作用力，巯基乙醇能打开二硫键。在有SDS和巯基乙醇存在下，单体蛋白或亚基的多肽链展开。SDS与蛋白质结合，使得多肽链带上大量的相同密度的负电荷，掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差异，使得不同蛋白质的电荷/质量比相同。此外在SDS的作用下，SDS－蛋白质复合物在水溶液中呈棒状，直径约为1.8nm，长度与蛋白质的相对分子量成正比。分子量小的蛋白质在凝胶中迁移速度快，分子量大的蛋白质在凝胶中迁移速度慢。
5．蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化主要涉及两个方面：①蛋白质与非蛋白质化合物的分离。②不同种类蛋白质之间分离。可以利用蛋白质与非蛋白质之间物理、化学性质的差异，以及蛋白质之间物理、化学性质的差异来分离蛋白质。
蛋白质溶解度的差异：不同的蛋白质在同一种溶剂中溶解度不同，同一种蛋白质在不同的溶剂中溶解度不同。主要有PEG沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法和热变性法。
蛋白质电荷性质的差异：不同蛋白质中含有的酸性氨基酸残基与碱性氨基酸残基的比例不同，它们的等电点不同，在一定的pH环境中带有的电荷性质和电荷量不同。因此可以用离子交换层析法和电泳法分离纯化蛋白质。电泳法主要有聚丙烯酰氨凝胶电泳、毛细管电泳、等电聚焦电泳和层析聚胶电泳。
分子大小的差异：可以根据蛋白质分子大小的不同，选用凝胶过滤法、超滤法、透析法和离心法来分离纯化蛋白质。
与配体亲和力的差异：根据不同的蛋白质能分别与相应的特异性配体非共价结合，利用亲和层析法可以分离纯化蛋白质。
6．蛋白质含量的测定
测定总蛋白质含量的方法有：凯氏定氮法、双缩尿法、Folin－酚法和紫外吸收法。测定某一种特定蛋白质的含量，可以用生物学的方法。对于酶或激素蛋白，可以利用它们的酶活性或激素活性来测定。对于不具备酶活性或激素活性的蛋白质，可以利用抗体－抗原反应来测定。
7．蛋白质纯度的鉴定
鉴定蛋白质纯度的方法主要有电泳法、高效液相层析（HPLC）法、溶解度分析法、沉降法和N末端氨基酸分析法。电泳法主要有等电聚焦电泳，毛细管电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。如果是纯的均一的蛋白质，电泳法、高效液相层析法分析图谱上只出现一个条带或一个峰。
三、重点、难点
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重点：氨基酸的结构，氨基酸侧链的物理、化学性质与多肽和蛋白质的结构和功能的关系。氨基酸的两性性质，氨基酸的化学性质与应用。蛋白质一级结构的测定，肽的结构与功能。蛋白质的二级结构，蛋白质的高级结构，生物体内蛋白质的功能，蛋白质的变性与复性，蛋白质的折叠。纤维蛋白质的结构特征与功能，球状蛋白质结构特征与功能。肌红蛋白与血红蛋白的结构特点和氧合曲线。免疫球蛋白的结构与功能，酶联免疫吸附分析法（ELISA）。蛋白质的分离纯化方法及纯度鉴定。
难点：氨基酸的结构与蛋白质的结构和功能的关系，氨基酸滴定曲线，氨基酸的化学反应及其应用，蛋白质一级结构的测定，蛋白质的二级结构，球状蛋白质的结构与功能，寡聚蛋白的结构与功能，肌红蛋白与血红蛋白的氧合曲线，蛋白质的分离纯化方法。
四、典型例题解析
例题3-1：对蛋白质中自然发生的氨基酸替换的研究结果如下，请解释下列现象。 （1）丝氨酸的替换最不容易引起蛋白质功能的改变。 （2）色氨酸的替换最容易引起蛋白质功能的改变。
（3）Lys→Arg和Ile→Leu这样的替换一般对蛋白质的功能基本没有影响。
解:蛋白质分子中，氨基酸残基侧链基团的大小、电荷性质和极性的改变都可能引起蛋白质结构的变化，从而影响蛋白质的功能。
（1）Ser具有一个中等大小的侧链，侧链是极性的，不带电荷。极性不带电荷的残基（Asn、Gln或Thr）或者极性带电荷的残基（Arg、Asp、Glu或Lys）有可能取代Ser，不会显著破坏蛋白质的构象。
（2）Trp侧链的的疏水性最强，往往出现在球状分子的内部。在蛋白质疏水核内，Phe苯环形成的范德华力的能力比Trp吲哚环的要小，会引起蛋白质的结构发生显著变化，影响蛋白质的功能。
（3）Lys和Arg的侧链都带正电荷，且长度相近。Ile和Leu大小相似，且都疏水。这两种替代几乎不影响蛋白质的整体构象，因此不会影响蛋白质的功能。
-9 例题3-2：（a）Tris是一个弱酸（Ka=8.3×10mol/L，它是生化实验中常用的缓冲剂。问在pH8.00时，
Tris有其共轭酸（Tris-H）的比值是多少？（b）若上述溶液中Tris的总浓度为100mmol/L，在加入5mmol/L(H)后，溶液pH值是多少？若Tris的总浓度减少到20mmol/L，pH变化又是多少？
解：（a）因为pH=pKa+1g（[Tris]/[Tris-H]） pKa=-1gKa=8.08
所以8.00=8.08+1g（[Tris]/[Tris-H]） [Tris]/[Tris-H]=0.83 (b)若[Tris]+[Tris-H]=100mmol/L 则根据（a）中结果可得： [Tris]=45mmol/L [Tris-H]=55mmol/L
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当加入5mmol/LH后，则[Tris]减少5mmol/L，而[Tris-H]增加5mmol/L，即：
[Tris]=4 0mmol/L
[Tris-H]=60mmol/L 因此 pH=pKa+1g（[Tris]/[Tris-H]） 8.08+1g（40/60）=7.9 即加入5mmol/LH可使pH降低0.1单位。 若Tris的总浓度为20mmol/L，则 [Tris]+[Tris-H]=20mmol/L [Tris]/[Tris-H]=0.83 所以 [Tris]=9mmol/L [Tris-H]=11mmol/L
加入5mmol/LH后，则[Tris]减少到4mmol/L，而[Tris-H]增加到16mmol/L， pH=pKa+1g（[Tris]/[Tris-H]） 8.08+1g4/16）=7.48
即此时加入5 mmol/L可使pH降低0.52个单位。
例题3-3：用阳离子交换层析分离下列每一对氨基酸，用pH7的缓冲溶液洗脱，哪一种氨基酸先从离子交换柱上流出，为什么？A. Lys与Met。B. Lys与Asp。C. Glu与Met。D. Gly与Leu。E. Ser与Ala。
解：影响氨基酸流出顺序的主要因素是：
（1）pH7时氨基酸的电荷性质和电荷量，通常等电点低的氨基酸带有负电荷，不与阳离子交换树脂结合，因此会先流出，反之，带正电荷，后流出。
（2）电荷量相同或相近时，侧链R基团疏水性强的氨基酸与树脂基质作用力大，因此会后流出。 A. Met先流出。Lys的等电点pI=9.74，Met的等电点pI=5.75，在pH7时Lys带有一个的正电荷，与阳离子交换树脂结合牢固。而Met带负电荷，不能与阳离子交换树脂结合，因此Met先流出。B. Asp先流出（Asp的pI=2.97）。 C. Glu先流出（Glu的pI=3.22）。D. Gly先流出（Gly的pI=5.97，Leu的pI=5.98）。这两种氨基酸的等电点几乎相同，这时要考虑它们的侧链基团的疏水性。Gly的侧链基团的疏水性比Leu的小，与树脂基质作用力小，因此Gly先流出。E. Ser先流出。Ser的等电点是pI=5.68，Ala的等电点是pI=6.02，而且Ala侧链的疏水性比Ser的大。
例题3-4：结合肌红蛋白和血红蛋白的氧合曲线，简述动物体内的氧从肺中转运到肌肉中的过程。肺泡中的p（O2）为100torr，肌肉的毛细管中p（O2）为20 torr，P50=26torr。血红蛋白在肺泡中的Y值是0.97，在肌肉的毛细管中的Y值是0.25。肌红蛋白的P50=2torr。
解：肌红蛋白是单亚基的氧结合蛋白，它的氧合曲线是双曲线。血红蛋白是含有4个亚基的氧结合蛋白，亚基间存在协同效应，它的氧合曲线是S形曲线。血红蛋白在肺泡中的氧分数饱和度Y是0.97，因此肺泡中的血红蛋白能大量地结合氧，并且将氧运到肌肉组织中。在肌肉毛细血管中，血红蛋白的氧分数饱
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