发布时间 : 星期二 文章灭菌法更新完毕开始阅读
据药物和制剂的具体情况，选择适宜的灭菌方法，做到既杀死或除去微生物，达到灭菌目的，又保证药物的治疗作用和稳定性 医学教 育网收集整理 。审评工作中注意到申报的部分注射剂品种其灭菌工艺存在问题，如灭菌方法选择不当、采用的灭菌温度偏低或灭菌时间偏短等，不能达到灭菌要求。本文对注射剂灭菌工艺涉及的有关问题做简要介绍，供注册申请人选择研究制剂灭菌工艺时参考。 1 无菌保证水平和无菌检查 灭菌制剂的无菌保证水平（SAL, sterility assurance level）是指灭菌后制剂中微生物的残存概率。为保证用药安全，注射剂等要求无菌的制剂中微生物的存活概率（SAL）不得高于10－6（即每一百万注射剂终产品中存活微生物的不得多于1个）。灭菌制剂的无菌保证水平可通过验证确定。 无菌检查是灭菌制剂质量控制的一个重要指标。但无菌检查是抽样检查，而微生物污染属非均匀污染，由于抽样的概率问题，无菌保证水平不符合要求往往难以用无菌检查结果反映出来，除非是较严重污染的情况。因此，灭菌制剂的无菌保证不能依靠终产品的无菌检查结果，而是取决于生产过程中采用合格的灭菌工艺、严格的GMP管理和良好的无菌保证体系。 2 注射剂常用灭菌工艺 注射剂常用灭菌方法包括湿热灭菌和过滤除菌法。 2.1 湿热灭菌法 系指将物品放在灭菌器内，利用高压饱和蒸汽等手段进行灭菌的方法。蒸汽潜热大，穿透力强，容易使微生物蛋白质变性凝固，灭菌能力强，因此湿热灭菌是最有效及用途最广的灭菌方法。注射剂制备中常用的湿热灭菌法包括热压灭菌和流通蒸汽灭菌。 2.1.1 热压灭菌法 系在密闭的灭菌容器内，用压力大于常压的饱和水蒸气加热进行灭菌的方法。若压力和灭菌时间选择适当，该法就能杀死所有的细菌繁殖体和芽孢，灭菌效果可靠。 各种微生物对湿热的抵抗力不同。细菌孢子较细菌对湿热的耐受力更强。饱和蒸汽的温度愈高，则达到灭菌目的所需时间愈短。然而在一个大气压下煮水，其温度最高只可达100℃，除非用很长时间，否则很难将一切细菌孢子杀灭。如欲使湿热的温度提高到100℃以上，则需采用热压方法。热压灭菌的压力越高，所需时间越短。注射剂灭菌中通常采用的灭菌条件为121℃×15分钟或115℃×30分钟。注射剂灭菌也可采用其他温度和时间参数，但必须保证制剂灭菌后的SAL≤10－6。 2.1.2 流通蒸汽灭菌法 系在不密闭的容器内，用流通蒸汽加热进行灭菌的方法。灭菌时间一般为30～60分钟。由于流通蒸汽的温度最高只能达到100℃，故不能保证杀灭所有的细菌孢子。当药液中加有适当抑菌剂时，经100℃加热30分钟，可杀死耐热性细菌孢子。注射剂中小容量注射液在严格监控灭菌前产品微生物污染的前提下，可采用流通蒸汽灭菌，一般1～5ml的注射液可用流通蒸汽100℃灭菌30分钟，10～20ml的注射液可以100℃灭菌45分钟。凡对热稳定的产品，建议采用热压灭菌。 2.2 过滤除菌法 本法系用滤过方法除去活的或死的微生物的方法，是一种机械除菌的方法。本法主要用于对热极不稳定的药物小针剂或冻干粉针制剂的除菌。生产上应配合无菌操作技术及无菌检查，相关的设备、包装容器及其他物品应采用适当的方法进行灭菌，以保证除菌工艺的质量。 过滤除菌法的除菌过滤器采用孔径分布均匀的微孔滤膜作过滤材料，为保证阻止细菌和细菌孢子通过滤器，滤膜的孔径一般不超过0.22μm。过滤器不得对被滤过成分有吸附作用，也不能释放物质。滤器或滤膜在使用前应进行洁净和灭菌处理，在除菌滤过前后均应作滤器的完好性试验。为保证过滤除菌效果，可使用两个灭菌过滤器串联滤过法。 3 灭菌工艺的验证 为保证灭菌效果，必须对灭菌方法的可靠性进行验证。对于热压灭菌，F0值（灭菌程序所赋予待灭菌物品在121℃下的等效灭菌时间）为反映灭菌可靠性的参数。热压灭菌的F0一般不得低于8。 灭菌效果可采用生物指示剂进一步确认。生物指示剂系一类特殊的活微生物制品，可用于确认灭菌设备的性能、灭菌程序的验证、生产过程灭菌效果
的监控等。用于灭菌验证的生物指示剂一般是细菌的孢子。对生物指示剂的要求之一是其对灭菌工艺的耐受性应大于需灭菌产品中所有可能污染菌的耐受性。对于湿热灭菌，最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子；对于过滤除菌，最常用的生物指示剂为缺陷假单孢菌。 4 输液剂灭菌需关注的问题 输液剂（大容量注射剂）由于体积较大，热不容易穿透，为保证灭菌效果，不适合采用流通蒸汽灭菌法；同样，由于容量大也不适合应用过滤除菌法。输液剂通常应采用热压灭菌法进行灭菌，同时热压灭菌的温度和时间应达到无菌保证的要求。 有的注册申请人在改剂型品种（小水针、粉针、输液剂）的研发中，将一些对热不稳定的药物改成输液剂申报。由于该类输液剂不能耐受常规热压灭菌，申请者采用流通蒸汽灭菌法进行灭菌，或者降低热压灭菌的温度或缩短时间，并且误认为终产品有无菌检查，可保证产品的无菌要求。如前所述，由于流通蒸汽灭菌不能保证杀灭所有的细菌孢子，热压灭菌温度及时间不符合要求不能保证灭菌效果，而无菌检查为抽样检查，也不能确证制剂的无菌保证水平，因此，此类输液剂采用的灭菌工艺不能满足无菌保证的要求，若在临床应用存在严重的安全性风险。 对于热不稳定的药物，建议制成注射剂时首先考虑选择粉针剂，也可考虑小水针。需要注意如果制剂不能耐受热压灭菌，制成输液剂一般是不适宜的。 [医
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1， 两种灭菌方法
蒸汽-湿热灭菌工艺开发和应用，可采用两种方法：过度杀灭法（the overkill method）和生物负载法（the bioburden method）。生物负载法也可称为存活概率法。
1.1 过度杀灭法
工业上蒸汽灭菌周期的设定和应用，一般使用过度杀灭法（the overkill method）。使用过度杀灭法的目标是确保达到一定程度的无菌保证，而不管装载物的实际负载生物的数量多少和抗热性如何。假定生物负载的数量和耐热值设为如下水平：
N0＝106
D121＝1分钟 Z＝10℃
为了达到无菌保证水平SAL小于10-6，NF＝10-6，利用上面这些数值，可以计算出为达到致死率所需的FPHY和FBIO如下：
F0＝D121×（LogN0－Log NF）＝12分钟
很少发现自然生成的微生物拥有超过0.5分钟的D121值。过度杀灭法假设的生物负载数量和抵抗力都要高于实际。大多数微生物的耐热性都要比这低，因此能够提供很高程度的无菌保证。
即便采用蒸汽-湿热灭菌工艺为过度杀灭法（the overkill method），仍然需要对被灭菌产品的初始菌进行周期监测，并定期采用生物指示剂测试。
1.2 生物负载法
通常来说不耐热产品或物品的灭菌就不能使用过度杀灭法了。这就需要我们所建立的灭菌周期必须能恰当地杀灭微生物负载，但是不能导致不可接受的产品分解。这样的灭菌周期的建立就有赖于研究产品上的微生物数量和耐热能力。一旦微生物负载的数量和耐热能力得以明确，就可以设计出一个能达到SAL小于10-6的灭菌周期。
按CGMP规范生产的产品实际生物负载数量应该是很低的，每个包装约在1～100CFU，对产品给予80～100℃下10～15分钟热休克，可以杀灭耐热值低的微生物。例如：
产品的生物负载测试中，测得： N0＝102
D121＝1分钟 Z＝10℃
则达到无菌保证水平SAL小于10-6，NF＝10-6，利用上面这些数值，可以计算出为达到致死率所需的FPHY和FBIO如下：
F0＝D121×（LogN0－Log NF）＝8分钟
生物负载法需有实测产品活菌计数和耐热性筛选程序。必须取得足够的有关生物负载数据，亦建立历史资料。对生物负载筛选次数的要求，取决于历史资料的质量和变化情况，被灭菌产品的种类、生产工艺和灭菌工艺的类型等等。若生产环境发生了变化，应考虑对生物负载进行补充监测。
对生物负载耐热性的测定，可将含生物负载产品样本在推荐灭菌工艺下作分级递增暴露时间处理，然后进行无菌检查试验，以测定在不同的暴露时间内存活的菌量，或存在的阳性样本比例。作为一种替代方法，生物负载微生物的耐热性可通过分离和繁殖，随后接种在产品上或适当载体上进行测定。不过，要注意繁殖会改变生物负载的抗性。此外，还应对常规生物负载的微生物耐热性进行测定。
就生物负载而论，具有湿热高度耐热性的微生物菌株有：生胞梭菌（Clostridium sporogenes），凝结芽孢杆菌（Becillus coagulans），枯草芽孢杆菌和嗜热芽孢杆菌等。
以生物负载法为依据的灭菌工艺，需经常进行微生物筛选，以测定与产品有关的生物负载数量和种类。在常规生产中，应从每一种生产设备中抽取具有代表性的产品样本，并设计生物负载监测程序，对产品部件及生产中，包括环境和生产过程中，任何可明显地影响生物负载地变化进行评定。
2， 用于注射剂生产的辅助物料的灭菌工艺
用于注射剂生产的部分辅助物料在生产过程中与药品直接接触，因此同样需要灭菌。它们包括：过滤器、胶塞、胶管、服装、不锈钢器皿、填充机械部件、清洁用品等等。一般通过与饱和蒸汽直接接触而实现灭活，湿热蒸汽的能量通过传导或对流作用传递热量。常用方法是建立能够提供相同的最小灭菌保证水平的标准周期，再加上一定的安全系数，不管装载物的内容是什么。
对于这类物品，获得可重复和可预测无菌保证的最大障碍是物品中潜在的空气，所以适合的灭菌过程是先采用预真空过程，然后饱和蒸汽灭菌的方法。预真空过程的效果明显优于重力置换过程。
对于预真空灭菌程序，灭菌过程开始之前对装载物的处理是很重要的。如果每次的真空度为0.1个大气压，那么每个脉冲将使灭菌器内的空气减少90％或者1个对数单位。可以增加为三个真空脉冲（蒸汽注入高于大气压，以避免空气进入灭菌腔室），使装载物处于正常状态。通过这个方法，空气去除的效率会提高，平衡时间会缩短。
典型的重力置换程序建立在如下的理论基础上：腔室中的冷空气重于进入的蒸汽并且将沉降到腔室的底部。蒸汽进入腔室的时候，空气和冷凝液一起从腔室底部的蒸汽疏水阀排出。去除空气过程的成功取决于对蒸汽疏水阀的准确操作和合适的蒸汽分布。蒸汽一般通过导流板或多孔管注入灭菌器腔室，如果蒸汽增加得过于迅速或者没有合理分布，装载物的顶部附近可能会产生气穴，如果蒸汽增加得过于缓慢，空气可能会被加热而混入蒸汽中，从而使空气去除更加困难。重力置换去除空气的效率低于其他方法，不推荐用于空气去除困难的物品。
对于多孔/坚硬物品的灭菌，需要确定以下操作参数（但不仅限于此）： 灭菌程序阶段 对参数的说明
灭菌程序全部 外壳温度/压力 外壳温度不能超过或者明显低于灭菌器腔室的灭菌温度。要控制温度避免过度加热或过度冷却。
监控探头记录探头
必须独立，并带有合适尺寸的记录纸以便记录灭菌程序全部的温度压力变化值
加热阶段
真空脉冲的次数、范围和持续时间（若使用） 用于多孔坚硬物品灭菌时的空气去除
正压力脉冲的次数、范围和持续时间（若使用） 用于在灭菌程序开始之前控制装载物
腔室加热
对于饱和蒸汽的灭菌方法，可以根据温度和压力的变化设置报警点
灭菌阶段 灭菌时间
对每个灭菌程序都是重要的控制参数
灭菌阶段的温度
对每个灭菌程序都是重要的控制参数
灭菌阶段的腔室温度波动
对每个灭菌程序都是重要的控制参数