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按照引物特点分类
PrimerSelect在自动将引物按照从好到坏的顺序分类以前，已经计算了引物的各个特点。Located Primers & Probes窗口是我们能够根据引物的不同特点，如引物位臵、长度、溶解点或自由能等，来对引物进行分类。这里让我们用溶解点来分类引物。
? 从报告菜单，选择Located Primers & Probes打开左面的窗口。窗口显示符合我们标
准的引物的一览表。在没有特别指定的情况下，引物按照位臵排列。 ? 从LOCATE MENU选择Sort Primers打开下边对话框。 ? 保留对正向和反向引物的选定，去除对By Position的选定。选定By Tm Nearest方框，
输入65。
? 单击同意，现在两个窗口里的引物按照融解温度离65oC最近的程度依次排列。
改变引物长度
PrimerSelect’s工作台允许你在引物中引入限制性酶切位点，突变，改变使用的密码子，核查引物二级结构，查找错配点。在这一节中，我们将用正向引物工作台来扩展我们的引物
长度。
? 双击选定正向“Best choice”引物。
? 从编辑菜单，选择Work on Upper Primer打
开下面的窗口。
? 确认Dimer，Hairpin和Priming Sites调色
板工具（窗口左侧从顶端起的4-6）已经激活。 让我们仔细查看一下工作台。在窗口下边的第3排可以看见引物序列。序列两端的三角形“handles”允许你缩短或者延长序列。在窗口的左上角的标题告诉我们引物的长度是23核苷酸，溶解温度为65.5度；而底部窗口的绿色棒显示引物在序列上的大概位臵。下面的信息告诉我们没
有大于2 bp的二聚体形成，并且引物只能形成一个并不理想的发卡样结构。拖动窗口左边的滚动条之间的黑框调整上下窗口的比例。
? 拖动引物左上黑三角形直到长度延伸到33核苷酸。
现在引物的长度已经显示在窗口的标题中。引物的溶解温度也增加到78.6度，将难以进行PCR。看下面的窗口有二聚体和发卡形成，并标记（坏！）。由于长引物容易形成稳定的二聚体和发卡样结构，所以我们设计的引物经常较短。
? 再一次拖三角直到引物最初的23核苷酸。窗口又和我们开始打开它的时候一样了。
引物中引入突变
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PrimerSelect工作台可以很容易的在引物中引入突变。我们“Best choice”的正向引物序列只编码一个苯丙氨酸。在这一节中，我们把读框1的苯丙氨酸通过改变读框中的密码子转换成苏氨酸。转换完成后我们将可以观察到我们变化的效果。
? 点击引物下面，读框1中绿色的苯丙氨酸，会出现一个小盒子（如右）。盒子中显示全
部4种可能的苯丙氨酸密码子和词“Other.”标记的GCC是这个苯丙氨酸残基的密码子。 ? 选择Other会自动跳出一个子菜单，其中显示所有的
氨基酸及其代号，在“T-Threonine.”上点击一下，模板序列上的碱基组成没有改变，但是引物序列和其编码的氨基酸（Thr-Ala）发生了改变。
Thr显示为红色，表明它是从最初的引物序列上突变得到的。查看屏幕底部的左角，可以看到引物形成了一个稳定的二聚体。我们可以通过给我们的Thr残基做沉寂突变来删除这个不受欢迎的二聚体。我们试着把苏氨酸的密码子改变为ACC。这个密码子与苯丙氨酸密码子（GCC）只有一个核苷酸不同。
? 单击红的Thr残基，从菜单中选ACC代替现在的ACT。 下面的窗口显示从G到A的单一的核苷酸变化去除了二聚体。另外，正向引物的融解点已经从65.5减少了到53.7。也许正向引物新的溶解温度可以与反向引物匹配，但是我
们可以找到与之更相匹配的反向引物。
? 在工作台的右上的白色文框输入突变引物的名字。 ? 点击窗口左侧顶端的OK钮，保存突变的引物。
? 从LOCATE MENU中选择PCR Primer Pairs更新窗口。新的引物对会加入窗口中，突变
的正向引物用淡绿色的箭头表示。
? 打开建议帘。没有警告的第一个突变引物对是从顶端起的第11个。这一引物对被评定
为“OK”，如果我们必须使用突变引物的话，虽然用它扩增的产品数量不多，但是它却是我们最好的选择。
设计新引物
当你初次打开PrimerSelect的时候，引物目录是空的。如果你愿意，你可以用这个目录来储备任何在PrimerSelect中设计或者被修改的引物。LOCATE MENU中的Only Cataloged Primers指令可以让你在已经储存地引物中选择合适的引物供使用。在这一节中，我们学习如何设计引物并将他们输入目录表的方法。 ? 从LOG MENU选择Primer Catalog打开引物目录表。注意到我们突变的正向引物已经在
目录表中。引物左面的检测标志表明引物处于激活状态，Ｖ形臂章（>>）（视窗）或子弹（苹果计算机）显示它已经通过了最初二级结构检测。 ? 按回车键创建一个新的引物区。输入“Test Primer”。 ? 按Tab键。
? 输入“GIANTCATSNABMANYWARYRATS”。 ? 按Tab键。
? 输入“Contains 46% ambiguous bases”。 ? 按回车键结束。引物目录表应该如右图。 如果我们的引物已经通过了最初二级结构检测，
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则引物左侧出现Ｖ形臂章或枪弹。现在没有Ｖ形臂章或枪弹，说明我们引物测试失败。让我们核查为什么：
? 从报告菜单，选Primer Self Dimer，可以看出该引物可以形成12对稳定的二聚体。 ? 从报告菜单，选Primer Hairpins，可以看出该引物也可以形成5个稳定的发卡。 如同我们预测的那样，我们序列里的模糊碱基的百分比过高会使得它那以用来进行PCR反应。
使用寡核苷酸订购表
PrimerSelect提供两种寡核苷酸订购表：Generic 和 IDT (Integrated Data Technologies, Inc.)。
? 点击选定正向“Best choice”引物。
? 从LOG MENU选择Oligo Request Form中的IDT打开IDT寡核苷酸订购表（如右）。我
们反向和正向引物序列自动输入表格。如果我们想定购引物，我们只需填表打印，然后传真或用电子信件邮给页底部的地址即可。
? 从文件菜单，在返回附近到坐落的
引物一对窗口口做选择。
PrimerSelect文件保存 ? 从文件菜单，选保存。
? 选定文件的保存位臵，命名。
?
单击保存（苹果计算机）或同意（视窗）。任何对引物，或者引物目录表的操作都将和文件一起被保存。
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Protean的使用方法
Protean可以使用多种方法分析、预测蛋白质结构，并以图形化的方式展示出来。预测蛋白质结构。各类方法按照科学概念进行分类。几个方法可以同时存在于一个概念群中，如用于分析疏水性概念的方法就有好几种，不过有的概念只有一种方法可供选择，如柔韧性。你可以按照任何顺序在Protean文件上展示各种方法计算的结果。另外，Protean可以输入来自蛋白质数据库中标注序列特点，而且允许你注释新特点。和其他Lasergene应用程序一样，Protean也提供整合的BLAST查找功能。
创建蛋白质分析文件
这一节，我们将为人的钙调蛋白序列创建一个新Protean分析文件。
? 从文件菜单选择New打开右面的对话框，然后打开名
为“Demo Sequences.”的文件夹。
? 双击“Human Calmodulin” (或 “Human
Calmodulin.pro”)，这样就打开下面的分析文件窗口：
Protean’s蛋白质分析方法 打开序列后就是选择应用方法。方法结果的图形显示可以帮助你选择感兴趣序列的特点。对于我们打开的序列，你会发现只有下面方法中的几个被展示出来了，下列方法都可以使用： ? Title——给文件取名。 ? Ruler——给文件加标尺。 ? Sequence——显示序列。
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