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（2）受体细胞方面。受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还应与所转化的载体DNA性质相匹配，如pBR322转化大肠杆菌JM83株，其转化率不高于103/mg DNA，但若转化ED8767株，则可获得106/mg DNA的转化率。
（3）转化操作方面。受体细胞的预处理或感受态细胞的制备对转化率影响最大。对于Ca2+诱导的完整细胞转化而言，菌龄、CaCl2处理时间、感受态细胞的保存期以及热脉冲时间均是很重要的因素，其中感受态细胞通常在12-24小时内转化率最高，之后转化率急剧下降。对于原生质体转化而言，再生率的高低直接影响转化率，而原生质体的再生率又受诸多因素的制约。在一次转化实验中，DNA分子数与受体细胞数的比例对转化率也有影响，通常50-100ng的DNA对应于108个受体细胞或原生质体，在此条件下，加大DNA量并不能线性提高转化率，甚至反而使转化率下降。不同的转化方法导致不同的转化率，这是不言而喻的，五种细菌常用的转化方法的最佳转化率范围列在表3-12中，其中电穿孔法的转化率与质粒大小密切相关，但明显优于Ca2+诱导的转化，接合转化虽然转化率较低，但对于那些不能用其它方法转化的受体细胞来说不失为一种选择，如光合细菌大多数种属的菌株均采用接合转化方式将重组DNA分子导入细胞内。
五、转化细菌细胞的扩增
转化细胞的扩增是指受体细胞经转化后立即进行短时间的培养，如Ca2+诱导转化后的受体细胞在37℃培养一小时、原生质体转化后的细胞壁再生过程以及l重组DNA分子体外包装后与受体细胞的混合培养等。转化细胞的扩增具有下列三方面的内容：
（1）转化细胞的增殖，使得有足够数量的转化细胞用于筛选环节；
（2）载体DNA上携带的标记基因拷贝数扩增及表达，这是进行筛选单元操作的前提条件； （3）克隆的外源基因的表达，如果重组DNA分子的筛选与鉴定依赖于外源基因表达产物的检测，则外源基因必须在转化细胞扩增期间表达。总之，转化细胞扩增的目的只有一个，即为后续的筛选鉴定等操作创造条件。
第四节 外源基因导入真核细胞 一、导入酵母细胞 1. 菌株选择
①转化率高的菌株；②有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；③不育的菌株（不会与其他酵母接合）。
常用的如如：ura3-52、 trp1-289、leu2-3、leu2-112。 2. 酵母的转化方法
（1）利用原生质球进行转化 （2）利用Li+盐进行转化
二、导入植物细胞 1. 叶盘法（leaf disk) 2. 电击法（electroporation) 3.基因枪法（gene gun） 4. 农杆菌（agrobacterium）介导 三、导入哺乳动物细胞 1. 磷酸钙沉淀法
2. 脂质体（lipofectin）载体法 3. 显微注射法(microinjection)
第六章(3)目的基因导入受体细胞
第五节 转化子的筛选与重组子的鉴定（检）
外源DNA片段与载体DNA的连接反应物一般不经分离直接用于转化。由于重组率和转化率不可能达到100%的理想极限，因此必须使用各种筛选与鉴定手段区分转化子（接纳载体或重组分子的转化细胞）与非转化子（未接纳载体或重组分子的非转化细胞）、重组子（含有重组DNA分子的转化子）与非重组子（仅含有空载载体分子的转化子），以及期望重组子（含有目的基因的重组子）与非期望重组子（不含目的基因的重组子）。在一般情况下，经转化与扩增操作后的受体细胞总数（包括转化子与非转化子）已达109-1010，从这些细胞中快速准确地选出期望重组子的战略是将转化扩增物稀释一定的倍数后，均匀涂布在用于筛选的特定固体培养基上，使之长出肉眼可分辨的菌落或噬菌斑（克隆），然后进行新一轮的筛选与鉴定。
一、载体遗传标记筛选法
载体遗传标记法的原理是利用载体DNA分子上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组子。由于标记基因所对应的遗传表型与受体细胞是互补的，因此在培养基中施加合适的选择压力，即可保证转化子显现（长出菌落或噬菌斑），而非转化子隐去（不生长），这种方法称为正选择。经过一轮正选择，往往可使转化扩增物的筛选范围缩小成千上万倍。如果载体分子含有第二个标记基因，则可利用这个标记基因进行第二轮的正选择或负选择（视标记基因的性质而定），从众多转化子中筛选出重组子。
（一）抗药性标记筛选法
抗药性筛选法实施的前提条件是载体DNA上携带有受体细胞敏感的抗生素的抗性基因，如pBR322质粒上的Ampr和Tetr。如果外源DNA是插在pBR322的BamHI位点上，则只需将转化扩增物涂布在含有Amp的固体平板上，理论上能长出的菌落便是转化子；如果外源DNA插在pBR322的PstI位点上，则利用Tet正向选择转化子。
正选择获得的转化子中会含有重组子与非重组子。为了进一步筛选出重组子应再第二轮负选择。用无菌牙签将Ampr的转化子分别逐一挑在只含一种抗生素的Tc和Ap两块平板上。由于外源DNA片段在BamHI位点的重组，导致载体DNA的Tcr基因插入灭活，选择的重组子具有AprTcs的遗传表型，而非重组子则为AprTcr，因此重组子只能在Ap板上形成菌落而不能在Tc板上生长。只要比较两种平板上各转化子的生长状况，即可在Ap板上挑出重组子，但是如果转化子有成千上万个，这种方法非常耗时。其改进方法是利用影印培养技术，将一块无菌丝绒布或滤纸接触含有细菌菌落的平板表面，使之定位沾上菌落印迹，然后小心地用Tc板压在其上，菌落又印在Tc板的相应位置上，经过培养至菌落显现，Tc板就被影印复制出来。如果Ap板的转化子密度较高，则在影印复制过程中容易造成菌落遗漏，为重组子的筛选造成假象。
负选择操作较为繁琐，一种变负选择为正选择的程序如下：在经转化扩增操作后的细菌悬浮液中，加入含有氨苄青霉素、四环素和适量D-环丝氨酸的培养基，继续培养一段时间后，具有ApsTcs的非转化子被氨苄青霉素杀死，AprTcs型的重组子由于四环素的存在而停止生长，但不死亡，只有含空载质粒的AprTcr型非重组转化子可以生长，但在生长过程中被D-环丝氨酸杀死。细菌培养物经离心去除培养基，用新鲜的不含任何抗生素的培养基洗涤菌体，悬浮稀释，涂布在只含有氨苄青霉素的固体培养基上，长出的菌落便是AprTcs的重组子。
由抗药性基因进行重组子的正选择也可通过pTR262质粒载体实现，它由pBR322衍生而来，含有l噬菌体DNA的CI阻遏蛋白编码基因及其调控序列，pBR322上的Tcr基因则紧邻CI基因的下游，其表达受启动子PR的控制。pTR262空载时，CI基因表达的阻遏蛋白结合在操作子OR上，Tcr基因不能表达，因此非转化子和非重组子均不能在含有四环素的培养基上生长。当外源DNA片段插在CI基因的HindⅢ位点上时，CI基因灭活，Tcr基因在启动子PR的介导下表达，重组子在平板上长出菌落。
然而，经过上述程序筛选出的菌落的抗药性未必都来自载体分子上的标记基因，相当多的受体菌基因组中存在着一些广谱抗药性基因，它们通常为抗生素诱导表达。另外，受体细胞药物抗性的回复突变也是可能的，因此用抗药性筛选法选择出的重组子必须通过重组质粒的抽提加以验证，事实上这也是重组子鉴定必不可少的操作步骤。
（二）营养缺陷性筛选法
如果载体分子上携带有某些营养成份（如氨基酸或核苷酸等）的生物合成基因，而受体细胞因该基因突变不能合成这种生长所必需的营养物质，则两者构成了营养缺陷性的正选择系统。将待筛选的细菌培养物涂布在缺少该营养物质的合成培养基上，长出的菌落即为转化子，而重组子的筛选仍需要第二个选择标记，并通过插入灭活的方式进行第二轮筛选。营养缺陷性的筛选过程同样存在着受体细胞的回复突变问题，因而需要对获得的转化子作进一步的鉴定。
（三）显色模型筛选法
许多大肠杆菌的载体质粒上含有lacZ’标记基因，它包括大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因lacZ的调控序列以及氨基端146个氨基酸残基的编码序列，其表达产物为无活性的不完全酶，称为a受体。而许多大肠杆菌的受体细胞在其染色体DNA上含有b-半乳糖苷酶羧基端的部分编码序列，由其产生的蛋白质也无酶活性，但可作a供体。无论在胞内还是胞外，受体一旦与供体结合，便可恢复b-半乳糖苷酸的活性，将无色的5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）底物水解成蓝色产物，这一现象称为a-互补。
当外源DNA片段插到位于lacZ’基因内部的多克隆位点上时，生长在含有X-gal的平板上的重组子因lacZ’基因的插入灭活而呈白色，非重组子则显蓝色，由此构成颜色选择模型。有些大肠杆菌质粒（如pUC18/19）的标记基因为lacI’-lacOPZ’，其编码阻遏蛋白I的基因lacI是缺失的，因而不能在受体菌中合成具有操作子lacO结合活性的阻遏蛋白，lacZ’基因得以全程表达，筛选时只需在培养基中添加X-gal即可。另一些大肠杆菌质粒如pSPORT1，携带完整的lacI基因，能在受体菌中产生阻遏物，后者结合在相应的操作子上并关闭lacZ’，此时在筛选培养基中必须同时添加X-gal和诱导物异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG），才能根据颜色反应筛选重组子。显色标记基因通常只用于筛选重组子，而转化子的选择则主要利用抗药性标记或营养缺陷型标记
（四）噬菌斑筛选法
以l-DNA为载体的重组DNA分子经体外包装后转染受体菌，转化子在固体培养基平板上被裂解形成噬菌斑，而非转化子正常生长，很容易辨认。如果在重组过程中使用的是取代型载体，则噬菌斑中的l噬菌体即为重组子，因为空载的l-DNA分子不能被包装，在常规的转染实验中不会进入受体细胞产生噬菌斑。在插入型载体的情况下，由于空载的l-DNA已大于包装下限，所以也能被包装成噬菌体颗粒并产生噬菌斑，此时筛选重组子必须启用载体上的标记基因，如lacZ’等。当外源DNA片段插入到lacZ’基因内时，重组噬菌斑无色透明，而非重组噬菌斑则呈蓝色。
二、菌落原位杂交法
在许多情况下，期望重组子与非期望重组子之间无法用遗传学方法区分，菌落原位杂交法（又称探针原位杂交法）则能从成千上万个重组子中迅速检测出期望重组子，其前提条件是必须拥有与目的基因某一区域同源的探针序列。根据核酸杂交原理，探针序列特异性地杂交目的基因，并通过放射性同位素或荧光基团进行定位检测。
（一）原位杂交的操作程序
（1）将硝酸纤维素薄膜剪成比平板稍小的圆片，并覆盖在菌落密度适中的平板上，37℃培养一至两小时，在平板上作出相应的标记以利于辨认；
（2）用镊子将薄膜轻轻揭起，吸附菌体的一面朝上放置在预先被强碱溶液浸湿的普通滤纸上； （3）十分钟后，将薄膜转移至预先被中性缓冲液浸湿的普通滤纸上，中和NaOH。强碱可以裂解细菌，释放细胞内含物，降解RNA，并使蛋白和DNA变性。硝酸纤维素薄膜与单链DNA或RNA的吸附作用比双链核酸和蛋白质要强得多；
（4）将薄膜转移到清洗缓冲液中短暂浸泡三分钟，以洗去菌体碎片和蛋白质；
（5）取出薄膜，在普通滤纸上晾干，置于80℃干燥一至两小时，在此高温下单链DNA已牢固地结合在硝酸纤维素薄膜上；
（6）将薄膜浸入探针溶液中，进行杂交反应。
（7）杂交反应结束后，用离子浓度稍低的溶液清洗薄膜三遍，除去未特异性杂交的探针，晾干