发布时间 : 星期五 文章第39章 基因工程及蛋白质工程 - 图文更新完毕开始阅读
三．外源基因导入宿主细胞
外源基因导入原核细胞的常用方法有：转染，即用冰冷的CaCl2 处理后瞬间加热，将含有外源DNA的质粒导入感受态的宿主细胞；转化，即用噬菌体将外源DNA 导入感受态的宿主细胞；电穿孔法，即用脉冲高压电瞬间击穿细胞膜，将含有外源DNA 的质粒导入宿主细胞；? 噬菌体的体外包装，将含有外源DNA 的? 噬菌体DNA 与外壳蛋白在体外包装成噬
菌体，可以大幅度提高转化率，包装蛋白有商品出售。
外源基因导入酵母细胞的常用方法有：用蜗牛消化酶消化细胞壁，制成原生质体，再用CaCl2 和聚乙二醇处理，促进重组DNA 的吸收。 外源基因导入动物细胞的常用方法有：磷酸钙共沉淀法；DEAE-葡聚糖或聚阳离子促进吸收法；脂质体转染法；电穿孔法；病毒转染法；显微注射法。 外源基因导入植物细胞的常用方法有：用纤维素酶消化细胞壁，制成原生质体，再用CaCl2 和聚乙二醇处理，促进重组DNA 的吸收，也可使用电穿孔法和脂质体转染法；将外源DNA 插入Ti 质粒的T-DNA，借助土壤农杆菌将外源DNA 导入植物细胞；基因枪微弹射击法；显微注射法。
四．阳性克隆的筛选
1．快速裂解菌落鉴定分子大小
从平板中直接挑取菌落裂解后，不需要内切酶消化，直接进行凝胶电泳，与载体DNA 比较迁移率，
初步判断是否有插入片段存在，本方法适用于插入片段较大的重组子初步筛选。 2．内切酶图谱鉴定
对于初步筛选鉴定具有重组子的菌落，应小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶(1 种或2 种)切割重组子释放出插入片段，对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插入方向，然后凝胶电泳检测插入片段和载体的大小。 3．Southern 印迹杂交
为了进一步确定DNA 插入片段的正确性，在内切酶消化重组子，凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA 移至硝酸纤维膜上，再用放射性核素或非放射性标记的相应外源DNA 片段作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片段是否是所需的靶基因片段。 4．PCR 筛选重组子
一些载体的外源DNA 插入位点两侧，存在恒定的序列，用相应的引物对小量抽提的质粒DNA 进行PCR 分析，不但可迅速扩增插入片段，而且可以直接进行DNA 顺序分析。对于原核或真核系统表达型重组子，其插入片段的序列正确性是非常关键的，故有必要对重组子进行序列测定，DNA 序列分析现多采用自动测序仪完成。 5．菌落（或噬菌斑）原位杂交
菌落或噬菌斑原位杂交技术是先将转化菌直接铺在硝酸纤维素薄膜或琼脂平板上，再转移到另一硝酸纤维素薄膜上，用核素标记的特异DNA 或RNA 探针进行分子杂交，然后挑选阳性克隆菌落。本方法能进行大规模操作，一次可筛选5×105-5×106 个菌落或噬菌斑，对于从基因文库中挑选目的重组子，是一项首选的方法。 典型的细菌转化实验：
第二节 基因的分离、合成和测序
一．目的基因的来源
1．基因组DNA 的非特异性断裂
超声波处理基因组DNA 可得到300bp 左右的随机片段，高速组织捣碎器，控制一定的条件也能得到不同大小的DNA 片段，如将高分子量DNA1500r/m 捣碎30 分钟，可得到大约8kb 的DNA 片段。由机械处理产生的DNA 片段末端不一，断点随机，条件难以掌握，所以目前较少使用这种方法。
2．染色体DNA 的限制性内切酶解
Ⅱ型限制性内切酶可专一识别并切割特定的DNA 顺序，产生不同类型的DNA 末端。若载体DNA 与插入片段用同一种内切酶消化，可以直接进行连接。
内切酶识别的DNA 顺序长短与降解后DNA 产生的片段大小有直接关系。若识别顺序为4 个碱性对，则该顺序在DNA 链上出现的机率为44，即在碱基随机排列的前提下，每256 个碱基对就有一个切点。对于识别6 个核苷酸的限制性内切酶，其顺序出现的频率为46(4096)，可获得较大的DNA 片段，也可用于DNA 文库的建立。 3．通过mRNA 合成cDNA
基因组DNA中重复顺序和假基因占有很大比重，克隆完整的基因比较困难。用mRNA反转录成cDNA，得到相应的双链cDNA，再进行克隆，获得较完整的连续编码顺序，容易在宿主细胞中表达。