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有机溶剂沉淀等方法初步分离纯化，再用吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、高效液相层析和制备电泳技术等方法进一步分离纯化，得到纯酶溶液。 （5）结晶 调节纯酶液的pH，制备酶的晶体。
（6）保存 如果无法得到结晶，可以将纯酶液除盐，冻干后低温保存。也可将酶液制成25%或50％的甘油储存液，在－25℃或－50℃冰箱中保存。
10．米氏方程
米氏方程表示酶促反应的初速度与底物浓度的关系。米氏方程只适用于单底物酶促反应。单底物酶促反应包括异构酶、水解酶及大部分裂合酶催化的反应。
中间络合物学说：酶在催化化学反应时先与底物结合，形成中间复合物（ES），然后生成产物（P），并释放出酶。 米氏方的程讨论：
（1）米氏常数Km的意义 Km表示酶促反应速度达到最大反应速度的一半时底物的浓度。Km的单位与底物浓度的单位一致（mol2L或mmol2L）。
Km是酶的特征常数，Km的大小只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。
（2）Km可表示酶与底物的亲和力 如果一个酶有几种底物，则每一种底物各有一个特定的Km值，其中Km值最小的底物称该酶的最适底物或一天然底物。
Km越小，达到最大反应速度一半所需的底物浓度愈小，表示底物与酶的亲和力越大。 （3）相对速度（酶活性中心被占据分数Ys）
当反应速度达到最大反应速度时，此时的反应速度与底物浓度无关，只与总酶浓度成正比。这表明此时酶的活性中心已经全部被底物占据。当反应速度达到最大反应速度的一半时，表明此时酶的部位有一半被占据。 当一个酶的Km已知时，任何底物浓度下酶活性部位被占据分数为：
（4）米氏方程所作曲线的曲度，不随Km和Vmax变化而变化。因此任何米氏酶，到达任何两个特定最大反应速度分数
-1
-1
V[S]Ys??VmaxKm?[S]?的时，对应的底物浓度之比为常数。
设达到最大反应速度的0.9倍时，所需底物浓度为[S]0.9。根据米氏方程得到[S]0.9=9Km，[S]0.8=4Km，[S]0.7=2.33Km，[S]0.6=1.5Km，[S]0.5=1Km和[S]0.1=1/9Km。因此[S]0.9 /[S]0.1=81，[S]0.7/[S]0.1=21。 （5）双倒数作图法计算Km和Vmax
对米氏方程两边取倒数，即将实验所得的初速度数据v和[S]取倒数，得各种1/v和1/[S]值，将1/v对1/[S]作图，得一直线。
1纵截距 = Vmax
横线距 = －
斜率 =
1KmKmVmax11．多底物酶促反应的类型
米氏方程只适用于单底物酶促反应，如异构、水解及大部分裂合反应，不适用于多底物酶促反应。
按照底物与酶的结合顺序，分别用A、B表示不同的底物；按照产物从酶－产物复合物中的释放顺序，分别用P、Q表示不同的产物。
（1）有序顺序反应 2个底物与酶结合的先后顺序，以及2个产物从酶底复合物中释放的顺序都有严格的限制。底物A先与酶结合，然后底物B再与酶结合，A为领先底物。产物P先释放，产物Q后释放。例如乙醇脱氢酶。 （2）随机顺序反应 2个底物与酶结合时没有先后顺序，2个产物从酶底复合物中释放时也没有严格先后顺序。 （3）乒乓反应 底物A先与酶结合，生成产物P，当产物P释放以后，底物B再与酶结合，生成并释放产物Q。例如谷丙转氨酶。
12．酶的抑制作用
大多数都酶是蛋白质，使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用称为酶的失活作用。
使酶活力下降，但并不引起酶蛋白变性的作用称为抑制作用。抑制作用分为不可逆抑制作用和可逆抑制作用。 抑制剂：不引起酶蛋白变性，但是能使酶分子活性中心上某些基团发生变化，引起酶活性下降甚至丧失，此类物质称为酶的抑制剂。 (1)不可逆抑制作用
抑制剂与酶活性中心的必需基团共价结合，使酶的活性丧失，不能用透析、过滤等物理方法除去抑制剂而使酶恢复活性。
?非专一性不可逆抑制：此类抑制剂可以与一类或几类基团反应。它们不仅能和酶分子中的必需基团作用，同时也能和相应的非必需基团作用。主要有酰化剂、烷化剂、含活泼双键试剂、亲电试剂、还原剂、有机汞、有机砷、氰化物和重金属。
?专一性不可逆抑制：此类抑制剂仅仅与活性部位的相关基团反应。
专一性不可逆抑制剂可以分为Ks型专一性不可逆抑制和Kcat型专一性不可逆抑制剂。 (2)可逆抑制作用
抑制剂与酶以非共价键结合，引起酶活性的降低或丧失。可逆抑制剂与酶蛋白的结合是可逆的，可以用透折法除去抑制剂，恢复酶的活性。可逆抑制作用分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。
?竞争性抑制 抑制剂与底物竞争酶的活性中心，阻止底物与酶结合。竞争性抑制剂具有与底物类似的结构，可与酶形成可逆的EI复合物。增加底物浓度可以减小或解除此种抑制。
?非竞争性抑制 酶与底物结合后，可再与抑制剂结合；或者酶与抑制剂结合后，也可再与底物结合。抑制剂与酶活性中的以外的位点结合，抑制剂结构可能与底物无关。 ?反竞争性抑制 酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。 13．酶抑制动力学
（1）竞争性抑制 在再竞争性抑制中，底物或抑制剂与酶的结合都是可逆的。加入竞争性抑制剂后，Vmax不变，Km变大。
（2）非竞争性抑制 酶与底物结合后，可以再与抑制剂结合；酶与抑制剂结合后，也可以再与底物结合。加入非竞争性抑制剂后，Vmax变小，Km不变。
（3）反竞争性抑制 酶先与底物结合，然后才与抑制剂结合。加入反竞争性抑制剂后，Vmax和Km都变小。 14．温度对酶促反应速度的影响
酶促反应的速度在某一温度下达到最大值，这个温度称为酶的最适温度。温度对酶促反应的影响有两个方面：升高温度可以加快反应速度；超过最适温度后，酶蛋白开始变性失活，催化活性下降。这两种因素共同作用，在小于最适温度时，前一种因素为主；在大于最适温度时，后一种因素为主。 15．pH对酶促反应的影响
酶的催化活性受到环境pH的影响，在一定pH环境下酶的活性最大，而高于或低于此pH值时，酶的活性会降低。通常把酶表现出最大活力时的pH值称为该酶的最适pH。 pH影响酶促反速度的原因：
（1）过酸或过碱会破坏酶蛋白的空间结构，改变酶分子的构象，使酶的活性丧失。
（2）pH变化会改变酶分子和底物分子解离状态，影响酶与底物的结合与催化，降低酶活性。
（3）pH变化会影响维持酶分子空间结构的相关基团的解离，从而影响酶活性中心的构象，降低酶活性。 16．酶的激活
凡是能提高酶活性的物质，都称为酶的激活剂。酶的激活作用包括两种情况：一种是由于激活剂的存在，使一些本来有活性的酶活性进一步提高，这一类激活剂主要是离子或简单有机化合物。另一种是酶原的激活，这一类激活剂可能是离子或蛋白酶。
生物体内合成的酶，有时不具有生物活性，经过蛋白酶专一水解后，构象发生变化，形成酶的活性部位，变成有活性的酶。这些不具有活性的酶的前体称为酶原。消化系统的胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和羧肽酶等，它们都以酶原的形式在胰脏中储存。
17．酶的活性部位
酶的催化能力只局限在酶分子的一定区域，只有少数的氨基酸参与底物结合及催化作用。这个与酶活力直接相关的区域称为酶的活性部位或活性中心。
酶的活性部位可以分为结合部位和催化部位。结合部位负责与底物结合，催化部位负责催化底物键的断裂和新键的形成，决定酶的催化能力。
酶活性部位的特点：
（1）活性部位通常只占酶分子体积的1％－2％。 （2）酶的活性部位是一个三维实体。
（3）酶的活性部位并不是与底物的形状正好构象互补，而是在酶和底物的结合过程中，底物分子或酶分子的构象发生变化后构象互补。
（4）酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂隙内。 （5）底物通过次级键结合到酶分子上。 （6）酶的活性部位具有柔性或可运动性。 18．酶催化反应高效性的机理 （1）底物与酶邻近效应与定向效应
邻近效应显著提高了酶活性中心附近底物的浓度，定向效应使酶活性中心附近反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，使分子间反应转变成分子内反应，这两种效应大大提高了酶的催化效率。 （2）扭曲变形和构象变化的催化效应
酶与底物形成酶底复合物时，酶分子中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度发生变化，产生电子张力，使底物的构象发生变化，变得更接近过渡态，大大降低了反应的活化能。 （3）共价催化
共价催化有亲核共价催化和亲电共价催化。酶分子种的亲核基团或亲电基团能分别放出电子或接受电子，使得酶与底物形成一个不稳定的共价中间物，此中间物易变成过渡态，降低了反应活化能，提高了反应速度。 （4）酸碱催化
酸碱催化是通过瞬时的向底物提供质子或从底物接受质子以稳定过渡态，提高反应的速度底一类催化机制。酸碱的强度和给出质子或结合质子的速度影响酸碱催化反应的速度。 （5）金属离子催化
金属离子可以通过三种途径参加催化过程。通过底物为反应定向，通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还有反应，通过静电稳定或屏蔽负电荷。 （6）活性中心的微环境
疏水环境：酶活性中心附近往往是一个疏水的环境，介电常数低，可加强极性基团间的反应。 电荷环境：酶活性中心附近，往往有一个电荷离子，可稳定过渡态的离子，增加酶促反应速度。 酶催化反应的高效性是由于上述几种因素协同作用的结果，而非酶催化反应往往只有一种催化机制。 19．别构调节
调节物（效应物）与酶分子的非催化部位可逆地非共价结合，使得酶分子的构象发生变化，引起酶催化活性的改变，从而调节酶促反应的速度。
别构酶一般都是寡聚酶，表明当底物浓度发生较小变化时，如上升3倍，别构酶的酶促反应速度可以从0.1Vmax升至0.9Vmax 。这种S形曲线体现为，当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度地控制反应速度，这是别