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实时荧光定量PCR检测技术与其应用
微生物131 沈涛 201301220132
摘 要：实时荧光定量PCR（Real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，被广泛应用于基础研究、疾病研究、病毒检测和食品安全检测等方面，是分子生物学研究中的重要工具。本文对RT-qPCR技术的原理、检测流程及其应用进行了综述。
关键词： RT-qPCR 原理 应用
1 背 景
RT-qPCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭反应等优点成为分子生物学研究中的重要工具，能够实时检测记录PCR扩增产物的增加，克服了终点法定量PCR产物的不足，使准确定量RNA成为现实。然而受制于相关仪器、荧光染料和技术的发展。其应用一直都没广泛展开，近年来，随着仪器和试剂的快速发展，RT-qPCR技术才得以发展起来。
2 原 理：
RT-qPCR的原理是以荧光共振能量转移原理为基础。荧光共振能量转移原理是当一个荧光分子(供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(受体分子)的激发光谱重叠时，供体荧光分子自身的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。ct值是RT-qPCR中一个很关键的因素，C代表循环，t代表阈值。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线。因此，根据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR产物的数量呈对应关系，只要对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样品的ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。与普通PCR相比，RT-qPCR可以利用荧光信号实时监测PCR反应过程中每一个循环扩增产物的变化，可以对初始模板量进行定量分析。
3 流 程
一个典型的RT-qPCR试验流程包括试验设计、RNA提取、引物和探针设计、RTPCR、数据分析、对照组、重复数等。 3.1 RT-qPCR试验设计
由于mRNA的超敏感性，反应需要在严格的调控下进行，适当的试验设计是研究基因表达成功的关键。试验设计内容包括样品抽提方法、保存方法、解冻和均质化过程、对照组设置、靶基因和内参基因选择，生物学和技术重复次数等都要进行严格的考虑，从而可以减少试验结果的可变性，保证其顺利进行。 3.2 引物和探针设计
引物设计是PCR步骤中十分关键的一步，引物的好坏决定着试验的成功与否。对于
RT-qPCR，引物设计和目标序列选择的要求更为严格了。依照MIQE指南，荧光定量PCR的引物必须是以2 个外显子设计引物，避免基因组DNA的扩增，设计好的引物还要通过NCBI中的Primer-Blast来进行比对，以确保目的基因的特异性[7]。 3.3 RT-qPCR扩增与验证
RT-qPCR扩增流程中，PCR的效率、线性动态范围、退火温度、融解曲线等，都要经过测定和校准。引物的优化、引物浓度、退火温度都会影响到PCR的效率，进而影响试验的质量。目前，常用ΔΔCt法对样品和内参基因不同浓度进行归一化，从而可以控制由抽提率、反转率和扩增效率产生的差异[8]。但前提是目的基因和对照基因必须具有相似的扩增效率。
3.4 数据分析
数据分析方法因所选定量方法的差异而有所差异。目前常用的RT-qPCR方法分为绝对定量和相对定量。绝对定量是使用系列稀释已知浓度的标准品进行标准曲线的制作，从而对未知浓度的样品进行拷贝数的测定；相对定量是通过分别测定目的基因和参比基因的量，通过计算目的基因相对于参比基因的量，从而进行样品间相对量的比较，内参基因一般选择一些在细胞内或者各种状态下表达相对恒定的基因，如β-actin、18S rRNA、GAPDH等。 3.5 内参基因
在RT-qPCR试验中，内参基因被用来作为数据标准化的对照，以校正作为模板的cDNA所存在的数量差异。一个好的内参基因应确保在不同的组织、不同的处理条件下表达都无变化。往往在试验中，要选用多个内参基因进行比较，而选择好的内参基因，才能确保得到令人信服的试验数据。
3.6 试验重复性与重现性
试验中有生物学差异和技术差异都可能会影响到试验的准确性和重复性。生物学差异是不同个体或组织样品间基因表达的差异所致；技术差异是试验药品、器材不同和操作不当等人为因素导致。为了减少生物学和技术差异对试验带来的影响，一般除了设置对照组，每个样本还要设置3个生物学重复，并且每个重复要设置至少2个技术重复，另外，再加上2个无模板（NTC）对照。
4 应 用
4.1 基因工程研究领域
RT-qPCR的出现不仅加强了有关对基因的量的研究方法，而且也加强了对基因的质所发生变化的研究。它可以检测基因突变和基因组的不稳定性，已经被广泛应用于遗传分析、基因表达研究、单核苷酸多态性及突变分析以及转基因的研究。 4.2 肿瘤的分子诊断
肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化，是一种多基因异常的疾病，这些异常变化用RT-qPCR都可以检测出来。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病RE基因、肿瘤MDR1基因等，尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全阐明，但相关基因的遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因之一已得到普遍承认。癌基因的突变和表达增加，在许多肿瘤早期就出现。RT-qPCR技术不仅能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。
4.3 病原体的分子检测
RT-qPCR已应用于肝病、性病以及人类免疫缺陷病毒等各种病原体的临床诊断，为实现快速准确诊断提供了有效的检测方法。目前，用此方法还进行了对人类结核杆菌、免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、巨细胞病毒、SARS病毒等病原体的检测。
5 总 结
准确、灵敏、快速和经济的RT-qPCR 技术己发展成为一项完全自动化的核酸定量技术，大大降低了假阳性率，工作效率高，结果重现性好，且不必使用对人体有害的染色剂RT-qPCR 应用较多的是医学方面较成熟主要是在病原体检测方面。在动物学等领域的研究中 该技术应用还较少。随着RT-qPCR技术与生物芯片技术、肽核酸技术微解剖技术等先进技术的整合，应用前景将越来越广阔。
参考文献：
1、张弛宇 徐顺高 黄新祥 一种新颖简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法的建立 生物化学与生物进展 2005 32（9）
2、刘小荣 张笠 王勇平 实时荧光定量PCR技术的理论研究及其医学应用 中国组织工程与临床康复 第14卷 第2期 2010.01. 08
3、陈 旭，齐凤坤，康立功，李景富 实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用 东北农业大学学报 第41卷 第8期 2010.08
4、刘 萌，董 亮 实时荧光定量PCR技术的原理、流程以及应用 Chin J Hemorh.2014;24(4)
5、赵焕英 包金风 实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展 中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志 第16卷 第4期 2007年8月
6、张贺 李波 周虚 谭建华 实时荧光定量PCR 技术研究进展及应用 动物医学进展 2006 ,27 <增>5-12