发布时间 : 星期日 文章BIAcore技术及其应用更新完毕开始阅读
被耦合入表面等离子体内 , 光能大量被吸收 , 在这个角度上由于表面等离子体共振引起界面反射光显著减少。由于 SPR 对金属表面电介质的折射率非常敏感 , 不同电介质其表面等离子体共振角不同。同种电介质 , 其附在金属表面的量不同 , 则 SPR 的响应强度不同。基于这种原理的生物传感器通常将一种具特异识别属性的分子即配体固定于金属膜表面 , 监控溶液中的被分析物与该配体的结合过程。在复合物形成或解离过程中 , 金属膜表面溶液的折射率发生变化 , 随即被 SPR 生物传感器检测出来等等。
BIACORE适用范围：
1. 检测蛋白质相互作用的特异性 2. 动力学：作用的速度 3. 亲和力：作用的强度 4. 浓度的测定
5. 复杂样品中的多重反应 BIACORE检测类型： 1. 蛋白质相互作用
2. 小分子化合物的作用如药物 3. 膜蛋白的作用 4. 核酸
5. 细胞和病毒 6. 碳水化合物
操作流程 1. Preconcentration:获得最佳的固定pH值https://www.biacore.com/lifesciences/service/online_support/techtips/index.html?d=946 可以下载相应的溶液以及程序 2. Immobilization：将配体与芯片藕联https://www.biacore.com/lifesciences/service/online_support/techtips/index.html?d=946 可以下载相应的藕联程序 3. Regeneration：选择合适的表面再生溶液https://www.biacore.com/lifesciences/service/online_support/techtips/index.html?d=946 可以下载相应的溶液以及程序
4. Interaction：分析物与配体的相互作用
5. Analysis：数据分析处理，得出合理的结论
BIACORE3000生物分子相互作用分析仪
BIA是基于表面等离子体共振（SPR）技术来实时跟踪生物分子间的相互作用，而不用任何标记物的技术。表面等离子体子共振( surface plasmon resonance , SPR) 是一种物理光学现象。在发生全反射的界面涂上一薄层金膜（或其它金属膜）约50nm厚，由于金膜中有自由电子，它们并不是静止不动而是不停在平衡位置附近振动，并具有一定的频率。当光由另一侧以大于临界角入射有金膜的界面，由于入射光会在界面方向有一分量，当这一分量与金膜中电子振荡频率相同时，两种能量会发生整合，使在某个角度上发射光能量降低，这个能量降低的角度成为SPR角。当紧靠在金属薄膜表面的介质折射率不同时, SPR角的位置将不同，根据SPR角的变化可以推断所发生的变化。
BIA是英语“Biomolecular Interaction Analysis” 的缩写，BIA提供了实时观察生物分子间相互作用的技术。通过它能观察两种分子结合的特异性，能知道两种分子的结合有多强，还能了解生物分子的结合过程共有多少个协同者和参与者。BIA可以让得到用其他技术方法难以得到的结果，因为它可以实时反映分子结合过程中每一秒变化的情况。无需借助标记物进行分析使BIA广泛应用于各类生物体系的测定，从各类小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸和寡聚糖直至类脂、噬菌体、病毒和细胞。BIA就是利用金属薄膜表面的折射率的改变，引起共振角的变化，来推断金属薄膜表面的变化。实验时先将一种生物分子固定在传感器芯片表面，将与之相互作用的分子溶于溶液流过芯片表面。检测器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表面分子的结合、解离整个过程的变化。 BIA技术应用的领域主要有四个方面：
1、动力学常数的测定2、测定样品浓度3、分析相互作用模式4、复合物功能分析
一、 动力学常数的测定通过实时监测结合在芯片表面分子质量的变化，可以得到两个分子之间的结合与解离常数。由于检测的是芯片表面质量的变化，所以大分子的分析物相互较容易得到较强的信号，但是对于小分子的分析物可以通过优化实验设计而进行检测。BIA可以用来分析不同抗体与抗原的结合与解离常数，相对与以前其它检测抗体效价的方法，BIA不仅快速，可以准确定量，和可以让你看到整个结合和解离的动态过程。二、浓度的测量如果简单地测量一个纯物质的浓度，有很多方法可以选择。但是如果想知道，某种复合物中其中一个组分的浓度，则很难实现。用BIA技术可以很轻松做到这一点。先将待测物的抗体耦联到芯片表面，再将一系列不同浓度的标样流过芯片，得到一条标准曲线，此时将混合物流过芯片，根据信号强度大小就可以得到原混合物中某组分的浓度。如果待测物很小，可以采取竞争的方法实现。三、分子相互作用模式的研究我们想知道两分子之间相互作用的比例，结合位点，抗原决定族的位点，都可以用BIA来完成。研究突变后活力大小的变化，研究复合物形成次序等等。四、蛋白质功能分析 复合物的组装可以看成研究蛋白功能的一个例子。也可以设计其它的一些实验，只要前后芯片表面的质量有变化就可以利用BIA技术来检测。
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四、实验步骤
1、preconcentration （预结合试验）由于芯片表面带有负电，因此要偶联到芯片上的分子必须带上正电，才有利于分子吸附到芯片表面，以利于共价偶联反应的完成。预结合实验就是将样品溶解在不同PH值的缓冲液中，使其带上不同量的电荷。然后，将样品流过芯片表面，观察它与芯片的结合曲线，就可判断出合适的条件。如下图：两种不同条件下的吸附实验，第一个峰表明在该条件下，吸附很快达到饱和，这样吸附的量有限，第二种一直呈上升趋势，有利于在芯片上偶联较多的蛋白。实际工作中，还会碰到各种不同的吸附曲线，需要根据实际情况来判断最佳条件。将抗体用不同PH值的buffer稀释10－40倍，以5μl/m的流速流过芯片表面，观察抗体与芯片的吸附结果。
2、偶联' X9 P! s) E( I( v! H
a)取100μlNHS和100微升EDC混合，12000rpm离心5分钟；
b)取一定体积的偶联蛋白，按预结合的比例稀释，稀释后需要150μl，取100μl ethanolamine HCL。以上试剂平衡到室温25摄氏度左右，高速离心五分钟； c)将上述三种试剂放在样品架上，设定加样流速为10μl/min ，inject方式进样，NHS/EDC,样品，ethanolamine-HCl分别上样100，100，和60μl。 d)结束即可得到类似下图的曲线。
3、结合
将抗原用合适的缓冲液稀释成适当浓度，离心后上样，观察抗原抗体结合过程。如果需要测量不同条件下的结合状况，可以在一次进样结束之后，对芯片进行再生。然后再上下一个样品。/ V5 l+ k9 R: J$ Q; U\ 4、芯片再生
抗原抗体结合的再生条件比较简单，简单地用PH2.5的10mMglycine冲洗就可以了。但实际工作中，如果偶联的是蛋白，往往情况要复杂得多。首先,再生条件要能将结合物从芯片上去掉，其次不能让结合在芯片上的蛋白变性失活。因为，万一所选条件使芯片上偶联的蛋白失活，这个通道就意味着报废。所以，芯片的再生是所有用户面临的一个比较头疼的问题。芯片再生要求再生之后，不仅要求基线要能回复到初始值，还要求再上相同的样品，结合能力不会出现明显下降。 5、如果需要得到结合与解离的动力学常数，至少需要进行五组不同浓度的结合实验。
6、分析实验结果，打印实验报告。
7、仪器维护，实验完毕，running buffer换成过滤并脱气的超纯水或HES－EP缓冲液。芯片更换为维护芯片，进行至少两遍prime后，运行standby。 收拾整理实验场所。