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碱性磷酸的提取分离纯化及其性质的研究
李小旭，赵彦彦，周晓倩，张林顺，伍红，林亚秋
摘要：从新鲜兔肝中提取碱性磷酸酶，进行分离纯化得到纯度较好的碱性磷酸
酶，然后测定其km，对最适温度及其热稳定性、最适pH及酸碱温度性的研究，最后用KH2PO4进行抑制剂类型鉴别。
关键词：温度、pH、酶、Km、抑制剂
前言：酶是具有生物催化功能的大分子，在一定的条件下，酶可催化各种生化
反应。酶的催化作用具有催化效率高，专一性强和作用条件温和等显著特点，所以酶在医药、食品、轻工、化工、环保、能源和生物工程等领域应用广泛。应用之前要先对酶的性质等进行研究，进行酶活力测定，研究抑制剂对酶活性的影响等等。在抑制剂的的作用下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能。抑制剂有可逆抑制剂和不可逆抑制剂之分。不可逆抑制剂与酶分子结合后，抑制剂难以除去，酶活性不能恢复。可逆抑制剂与酶的结合是可逆的，只要将抑制剂除去，酶活性即可恢复。根据可逆抑制剂作用的机制不同，酶的可逆抑制作用可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。酶活力测定的方法多种多样，有化学测定法、光学测定法、气体测定法等。对酶活力测定的要求是快速、简便、准确。酶活力测定通常包括连个阶段，首先在一定条件下，酶与底物反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物的变化量。而酶的活力高低，是以酶的单位数来表示的。1961年国际生物化学与分子生物学联合会规定，在特定条件下（温度可采用25℃，PH等条件均采用最适条件），每1min催化0.001mol的底物转化为产物的酶量定义为一个酶活力单位，这个称为国际单位。由于这个规定没有法律效力所以在现实使用的酶活力单位多种多样。国际上另一个常用的酶活力单位是卡特（kat）。在特定条件下，每秒催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（kat）。
1 材料与方法 1.1材料
1.11碱性磷酸酶的分离纯化实验
本实验使用的原料是新鲜兔肝，仪器有：离心机、搏力匀浆器等，试剂有：（1）0.5mol/L醋酸镁溶液（107.25g醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000ml）、（2）0.1mol/L醋酸钠溶液（8.2g醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000ml）、（3）0.01mol/L醋酸镁-0.01mol/L醋酸钠溶液（准确吸取20ml 0.5mol/L醋酸镁溶液及100ml 0.14mol/L醋酸钠溶液，混匀后定容至1000ml、（4）Tris-HCl pH8.8缓冲液（称取三羟甲基甲烷12.1g，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，即为0.1mol/L Trls溶液。取100ml10.1mol/LTrls溶液，加蒸馏水约780ml，再加0.1mol/L醋酸镁溶液100ml，混匀后用1%冰醋酸调pH为8.8，用蒸馏水定容至1000ml）、（5）正丁醇、丙酮、95%乙醇。
1.12 碱性磷酸酶的动力学鉴定——Km测定
本实验用的仪器有：水浴锅、721型分光光度计；试剂有：（1）0.04mol/L作用液（称取10.16g磷酸苯二钠C6H5PO4Na.2H2O，用煮沸后冷却的蒸馏水溶解，并稀释至1000ml，加4ml氯仿防腐，贮于棕色瓶内，置于冰箱内保存，可用一周）、（2）0.1mol碳酸盐缓冲液pH10.0（称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1000ml）、（3）碱性磷酸酶液、（4）0.5mol/LNaOH溶液、（5）0.3%4-氨基安替比林（称取3g4氨基安替比林及碳酸氢钠42g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000ml，贮于棕色瓶内，放冰箱保存）、（6）0.5%铁氰化钾（称取10g铁氰化钾及30g硼酸各溶于800ml蒸馏水中，溶解后两液混合加水至2000ml，置棕色瓶中，放冰箱保存）。
1.13 碱性磷酸酶的最适pH及酸碱稳定性试验
用到的仪器有：水浴锅、721型分光光度计；试剂有：（1）基质液（称取磷酸苯二钠.2H2O 6g，4-氨基安替比林3g，分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中，两液混合后并稀释至1000ml，加4ml氯仿防腐，盛于棕色瓶中，临时用着与等量的水混合即可）、（2）各pH值相应缓冲液（用0.2NNaOH、0.2M甘安酸配置成pH为8、9、10、11、12的缓冲液）。
1.14 碱性磷酸酶的最适温度及热稳定性实验
本实验所用到的仪器、试剂都跟碱性磷酸酶的最适pH及酸碱稳定性实验一样。
1.15 抑制剂类型鉴别实验
本实验用到的仪器有：水浴锅、721型分光光度计，试剂有：（1）0.5mol/L KH2PO4（称取KH2PO4 6.80g，加水溶解并定容至100ml）、（2）0.04M 磷酸氢二钠（称取磷酸氢二钠14.3g，溶解于0.1M pH10的碳酸缓冲液中，并用此液稀释至1000ml）
1.2 方法
1.21 碱性磷酸酶的分离纯化
本实验采用有机溶剂沉定法从肝匀浆中分离纯化碱性磷酸酶（AKP），首先用低浓度醋酸钠（低渗破膜作用）制备肝匀浆，醋酸镁则有保护和稳定AKP的作用，匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。含AKP在33%是丙酮或30%的乙醇中溶解，而在50%丙酮或60%是乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和乙醇重复分离提取，可从含有AKP的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。 实验的操作流程如下：（1）取新鲜兔肝20g剪成组织块（—4℃），加0.01mol/L醋酸镁—0.01mol/L醋酸钠30ml，在电动匀浆器上匀浆，得到肝匀浆。（2）取肝匀浆体积32.5ml，加10ml正丁醇，用玻璃棒充分搅拌3-5分钟后，置室温30分钟，用两层纱布过滤。（3）在滤液加23.5ml冷丙酮（—10℃）混匀，冰冻离心3000转5分钟。（4）弃上清液，在沉定里加0.5mol/L醋酸镁20ml，量体积为28.5ml。悬液，加96%乙醇12.5ml至30%，离心3500转5分钟。（5）取上清液33.5ml，加96%乙醇27.9ml至65%，离心3500转5分钟。（6）弃上清液，取沉定，加0.01mol/L醋酸镁—0.01mol/L醋酸钠20ml溶解，加96%乙醇9.75ml至30%，离心3500转5分钟。（7）去上清液29.5ml，加96%乙醇24.5ml，至60%，离心3500转5分钟。（8）取沉淀，加0.5mol/L醋酸镁15ml溶解，总体积17.5ml，加99.5%丙酮8.2ml至33%，离心3500转5分钟。（9）取上清液22.5ml，加99.5%丙酮7.65ml至50%，离心5000转10分钟。（10）取沉定，加pH8.8Tris缓冲液10ml，
分装成2ml瓶，置于—60℃低温冰箱保存。 1.22 碱性磷酸酶的动力学鉴定—Km测定
当温度、pH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随作用物浓度[S]增大而增大，但大到一定限度时，作用物浓度再增加，则反应不再增加，此时反应速度为最大速度（Vmax）。
V=Vmax[S]/（Km+[S]）或Km=[S][Vmax/V—1]
式中Km即为米氏常数，Vmax为最大反应速度，当V=Vmax/2时，则Km=[S]。 实验操作如下：（1）.取8支试管，按下表操作： 试 剂 管号
（ml） 1 2 3 4 5 6 7 8 0.04mol/L作用物液 0.15 0.20 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0 pH10碳酸缓冲液 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90
蒸馏水 0.85 0.80 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1.0
混匀，37℃预热5min
酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
加入酶液，混匀后立即计时，各管在37℃水浴中准确保温15min后，立即加入0.5molNaOH液1.0ml以终止反应。（2）.显色：各管中加入0.3%4氨基安替比林1.0ml和0.5%铁氰化钾2.0ml，充分混匀放置10min，以0管为对照，在波长510nm下比色，记录各管吸光度。
1.23 碱性磷酸酶的最适pH及酸碱性稳定性实验
pH对酶活性的影响极为显著，通常各种酶只有在一定的范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH条件下所表现的活性不同，其表现活性最高时的pH值为最适pH。pH对酶的稳定性也有很大的影响，一般实验方法是将酶液分成若干份，分别置于一系列不同的pH的溶液中保温处理一定时间，然后再调至某一标准的pH或直接在最适pH条件下进行活力测定。实验操作如下：（1）pH—活性曲线的制作：取6支试管，按下表操作：
管 号 1 2 3 4 5 0
反应pH 8 9 10 11 12 12
相应pH缓冲液 各加0.5ml
酶液 各加0.1ml（0号管酶液在铁氰化钾之后加） 37℃预热5min 预热的基质液 各加3.0ml
37℃精确保温15min各加1.0ml碱性溶液终止反应
0.5%铁氰化钾 各加2.0ml
静置10min后比色
以反应pH值为横坐标，A510为纵坐标绘制pH—活性曲线，求出碱性磷酸酶在本实验条件下的最适pH值。（2）酸碱稳定性范围的测定：取6支试管，按下表
操作：
管号 1 2 3 4 5 0
处理pH 8 9 10 11 12 12
相应pH缓冲液 各加0.1ml 酶液 各加0.1ml 37℃保温处理1hr 0.1MPH10碳酸盐缓冲液 各加0.5ml 预热的基质液 各加3.0ml（0号管基质液在铁氰化钾之后加）
37℃精确保温15min，各加1.0ml碱性溶液终止反应
0.5%铁氰化钾 各加2.0ml
静置10min后比色
以pH为横坐标，A510为纵坐标，绘制酸碱稳定曲线。 1.24 碱性磷酸酶的最适温度及热温度性实验
保持其他反应条件恒定，在一系列变化的温度条件下测定酶活力。由于酶受热后易变性失活，因此各种酶对热都有一个温度的范围。一般的实验方法是在一定条件下先将酶在不同的温度下处理一段时间，迅速降温，然后再在一定温度下测定酶活力。实验操作如下：(1)温度—活性曲线的制作：取4支试管，按下表操作：
管 号 1 2 3
0
反应温度（℃） 25 37 80
80
稀释酶液 各加0.1ml（0号管酶液在铁氰化钾
之后加）
预热基质液 各加3.0ml 分别在不用温度下精确反应15min，各加1.0ml碱性溶液
终止反应
各加0.5%铁氰化钾2.0ml
静置10min后比色
以反应温度为横坐标，A510为纵坐标，绘制温度—活性曲线图，求出碱性磷酸酶在本实验条件下的最适温度。(2)热稳定：取4支试管，按下表操作：
管号 1 2 3 0