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实验三 齐墩果酸的提取、分离及鉴定
一、实验目的
1、掌握三萜皂苷元的提取、分离和鉴定技术，熟悉三萜皂苷的性质。 2、掌握两相溶剂水解方法。
3、掌握碱溶盐析法提取萜类化合物的方法。
齐墩果酸又名庆四素，属五环三萜类化合物，广泛分布于植物界，已报道其以游离态、酯、苷或兼有的形式存在于150多种植物中，而多数是以苷的形式存在。但含齐墩果酸的量超过10％的甚少。从刺五加、龙牙楤木中提得率超过10％，纯度达95％以上，是理想的药用资源，是一种天然产物化学成分，并己证实其具有多种生物活性。
纯齐墩果酸是白色簇状结晶，无色、无味、无臭，熔点为308-31O℃，不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮和氯仿等有机溶剂。据研究证实，齐墩果酸具有消炎抑菌、增强免疫功能、降转氨酶、改善肝功能，纠正体内异常蛋白代谢，防止肝硬化、降血糖、降血脂等多方面的临床药理作用，它对急性黄疸型肝炎和慢性病毒性肝炎疗效显著，是国内研制的保肝、治疗肝炎的有效药物之一。此外，齐墩果酸还具有抗血栓形成、抗突变、抗艾滋病、抑制HIV-I的复制作用；以及强心、利尿和抑制S180瘤株生长等作用，其毒性小，副作用低，安全范围大。齐墩果酸还因其有抗衰老、抗突变、清除自由基的作用，还可以作为化妆品成分被广泛应用。
女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait．的干燥成熟果实，为常用的扶正固本中药。药理研究表明其促进免疫的主要有效成分为齐墩果酸、熊果酸及乙酰齐墩果酸。齐墩果酸以游离态和结合成苷的形式同存于女贞子中。经检测发现其齐墩果酸含量以幼果期（8月）含量最高，可达8.04％，随着发育成熟下降到2.5％左右。其在果实中的含量分布为外中果皮>全果实>内果皮>种仁。女贞子还含橄榄苦苷、D-甘露醇、硬脂酸、植物蜡等。
女贞子中主要有效成分：
（1）齐墩果酸：C30H48O3，白色针状结晶（95％乙醇），mp 305-306℃。可溶于热甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、丙酮等，不溶于水。
（2）熊果酸：C30H48O3，白色针状结晶（95％乙醇），mp 286-287℃。易溶于二氧六环、吡啶。可溶于热乙醇，微溶于苯、氯仿、乙醚，不溶于水。
（3）乙酰齐墩果酸：C32H50O5，白色簇晶。Mp 258℃-260℃。溶于氯仿、乙醚、无水乙醇，不溶于水。
齐墩果酸 R=H 熊果酸 乙酰齐墩果酸 R=OCOCH3
二、实验原理
根据女贞子中齐墩果酸以游离型和结合成苷的形式共存于果实中，采用酸水解，氯仿萃取同步法提取齐墩果酸。
根据女贞子齐墩果酸以游离型和结合成苷的形式共存于果实中，采用碱溶解，制备成钠盐形式，酸沉淀方法提取齐墩果酸。 三、实验材料：
1、器材：500ml圆底烧瓶、烧杯、水浴锅、滴管、球形冷凝管、索氏提取器、250ml分液漏斗、布氏漏斗、抽滤瓶、普通滤纸、旋转蒸发器、硅胶G-CMG-Na板、层析缸等；
2、药品及试剂：：女贞子果皮粗粉50g、5%氢氧化钠溶液、浓硫酸、浓盐酸、乙醇、丙酮、氯仿溶液、石油醚（沸程60-90℃）、冰醋酸、乙酸乙酯溶液、无水硫酸钠、乙酸酐 四、实验操作步骤：
1、酸水解和氯仿同步提取法
称取女贞子果皮粗粉25g，置于圆底烧瓶内，加15％盐酸溶液175 ml，氯仿125 ml，70℃水浴回流水解2h，过滤，分取氯仿提取液（在分液漏斗中进行，注意：氯仿在下，水在上，因为氯仿密度1.4916比水大，用水洗至中性，用无水硫酸钠脱水干燥、过滤，用过滤液）另存。药渣用水洗至中性，抽干，干燥药渣至含水量小于10％（摊平晾晒或低温烘干）。将干燥药渣置于圆底烧瓶内，加
氯仿250 ml回流1h，合并二次氯仿提取液，取出2 ml留待薄层鉴识，其余减压回收氯仿（用旋转蒸发器或常温挥干）至糖浆状，趁热转移至烧杯中，冷后成半固状物。
女贞子果皮粗粉
氯仿提取液
回流
回收氯仿至糖浆状
2、分离与精制
方法1：取上述半固状物，以少量石油醚洗涤．除去脂溶性较大的成分，即有固体析出，抽干，得浅黄色析出物。用1:100倍量（W／V）95％乙醇90℃回流10 min，过滤，滤液浓缩至小体积，放置，析出粗晶，抽滤得齐墩果酸粗品。反复用90％乙醇重结晶，可得较纯的齐墩果酸。 即方法1： 半固状物
浅黄色析出物
乙醇回流
齐墩果酸粗品
齐墩果酸
方法2：同方法1用石油醚处理得浅黄色析出物，加10倍量5%氢氧化钠溶液煮沸10 min，放冷后抽滤，适量热水洗涤1～2次，抽干得类白色析出物，用95％乙醇℃回流溶解，趁热过滤，盐酸调至pH l～2，放置析晶。抽滤得齐墩果酸粗品，用正己烷-乙醇（1:1）重结晶，可得较纯的齐墩果酸。
即方法2： 半固状物
浅黄色析出物
氢氧化钠溶液煮沸
乙醇回流
齐墩果酸粗品
齐墩果酸
3、鉴定 a．呈色反应
（1）取本品约50mg，加氯仿2ml溶解后，加硫酸2滴，振摇，静止，氯仿液自无色(或淡黄色)渐变为淡红色。
（2）取本品少量，加乙酸酐lml，微热使溶解，滴加硫酸1滴，即显紫红色，放置后色渐变深。
（3）取本品少量，加香草醛的冰乙酸溶液(香草醛0.5g，加冰乙酸10ml溶解，即得)0.2ml，加高氯酸0.8ml，置沸水浴中加热数分钟，显紫红色，加乙酸乙酯2ml，紫红色溶入乙酸乙酯中，放置不变色。
b．薄层色谱鉴别 薄层板：硅胶G-CMG-Na板
点样：女贞子氯仿提取液、自制齐墩果酸乙醇溶液、齐墩果酸对照品乙醇溶液（1 mg/ml）。
展开剂：氯仿-丙酮（95:5）、环己烷-乙酸乙酯（8:2）任选一种。 显色：喷10% 硫酸甲醇溶液，105℃烘至显色，日光和紫外光灯（365nm）下检识。
观察记录：记录图谱及斑点颜色。 4、计算得率
得率=得到的齐墩果酸成品（g）/称取得样品量（g）*100% 五、注意事项
1、女贞子中齐墩果酸的含量因采收季节、产地不同有较大差异，可根据原料含量酌增取材量。
2、用石油醚洗涤应控制用量，以防主成分的损失，也可用适量苯替代。 六、思考题
1、采用果皮作原料的优点是什么? 2、两相溶剂水解法的原理是什么? 3、本实验中采用皂化反应有何意义?
4、齐墩果酸和熊果酸在结构上有何差异？试述分离两者的方法。