发布时间 : 星期四 文章朱园园毕业论文更新完毕开始阅读
不同pH对猪精液常温保存效果分析
表1 猪精液常温保存稀释液配方
Table 1 Composition of different extenders used for liquid storage of boar semen
配方
Component
稀释液成分（g/ml)
Extender composition
无水葡萄
糖
Anhydrous glucose
柠檬酸三钠
Trisodium citrate
EDTA
·2Na
碳酸氢钠 Sodium
氯化钾 Potassim
柠檬酸 Citric acid
Tris
bicarbonate chloride
Modena BTS
2.1.7精液保存
27.5 37.15
6.90 6.00
2.35 1.25
1.00 1.25
0.75 0.75
2.90 —
5.65 —
将稀释精液置于17 ℃恒温箱中保存。 精液稀释后立即进行分装，从恒温箱中取出精液分瓶装，分装瓶的温度差不高于0.5 ℃。精液分装后不宜将精液立即放入17 ℃保温箱中保存，让精液在温室25 ℃缓慢降温后，再将其放入保温箱。每组试验测定精液pH，镜检活力达到0.7以上者供稀释保存用；对同头次所采精液分成7等份，分别按试验方案作7种稀释处理，稀释后在20～25 ℃恒温保存；按每24 h的时间检查1次精子活力，直至全部精子死亡，同时检测精子的畸形率，记录相应数据。
2.1.8数据处理
试验过程中，每个水平设置2个重复（本试验设2个重复受公猪一次射精量限制），使用单因素方差分析，结果用平均值±标准差表示，所有数据采用SPSS 20.0软件进行分析。
2.2 结果与分析
2.2.1不同保存时间精子活率的变化
13
不同pH对猪精液常温保存效果分析
表2 不同保存时间精子活率的变化
Table 2 Sperm motility in different time during storage periods
保存时间/d Conservation Time
Modena BTS
原精 Before dilute 0.867±0.006a 0.867±0.007a
稀释后 After dilute 0.843±0.012a 0.804±0.019a
1
2
3
4
5
0.807±0.015b 0.727±0.043b 0.783±0.015b 0.691±0.024b 0.747±0.012c 0.613±0.028c 0.703±0.015d 0.573±0.105d
0.630±0.020e -
注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。
由表2知，到5 d时Modena稀释液中精子平均活率为0.63高于4d时BTS稀释液中精子平均活率0.57。精液保存时间小于5 d时，Modena稀释液保存精子活率显著高于BTS稀释液（P<0.05）。
2.2.2不同保存时间精液pH的变化
表2 不同保存时间精液pH的变化
Table 2 Sperm pH in different time during storage periods
保存时间/d Conservation Time
Modena BTS
原精 Before dilute
7.01±0.473a 7.01±0.474b 稀释后 After dilute 7.35±0.700c 7.24±0.149c 1
2
3
4
5
7.29±0.115b 7.15±0.451c 7.24±0.100b 7.13±0.237c 7.35±07.42±0..379c 100c 7.02±06.84±0..258b 091a 7.49±0.
569d
-
注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。
由表2知，Modena和BTS稀释粉稀释精液后pH显著增加，这可能与稀释粉本身pH呈弱碱性有关。其中，Modena稀释粉保存精液随着保存时间的延长，pH不断升高，这可能是因为Modena稀释粉中添加了多种缓冲物质。BTS稀释粉保存精液随着保存时间的延长，pH不断下降，这可能与精子自身代谢产生酸性物质沉积有关。 2.3 讨论
2.3.1稀释粉对猪精子活力的影响
影响精液常温保存时间和精子活力的因素很多，主要有温度、稀释液的缓冲能力、组分等[18]，在同一温度下保存精液，稀释粉的组分对保存效果起着决定性作用
14
不同pH对猪精液常温保存效果分析
[19]
。本试验中精子所需要的能量主要由无水葡萄糖提供。蔡元等
[20]
通过在稀释液中
添加葡萄糖的用量以调节稀释液的渗透压，维持精子活率。高建明等[21]在猪精液常温研究中也得到类似结果，表明5%～7%的葡萄糖溶液有利于猪精子的有效保存。过酸过碱的环境都不利于精子生存，该稀释粉中添加有一定量的柠檬酸三钠、碳酸氢钠和Tris等缓冲物质以维持精液pH相对稳定[22]。碳酸氢钠或柠檬酸三钠常被用来调节稀释液pH，但Tris的缓冲能力更强[23]。
2.3.2稀释粉对猪精液保存过程中pH的影响
新鲜精液的pH在7.2～7.5之间，当pH低于这个范围时，精子的运动性和新陈代谢都逐渐降低[24]。大多数稀释粉中高浓度的葡萄糖能使精子细胞内的pH降至6.0以下，这种酸性环境可以延长精子的体外保存时间[25]。但如果稀释液的pH超出一定的酸性范围，容易引起精子死亡，因此稀释液中应添加适量的缓冲剂以维持pH[]。在弱酸性条件下，稀释粉的pH为6.5～6.9时保存效果明显好于pH为6.0～6.4与5.5～5.9的保存效果。戈新[26]等通过测定了26种商品稀释液的pH表明，稀释液pH都在6.36～7.26之间，且大多数的稀释液的pH呈弱碱性。陈大芳[27]研究得出稀释液pH在6.5左右保存效果较好，高飞[27]等也得出稀释液pH在6.0～6.5之间，稀释后精液pH在6.5～7.0之间，对延长精子寿命具有显著效果[28]。本试验测定在有效保存时间内，稀释精液pH在6.80～7.50之间，也是中性偏弱碱性，这可能是因为弱碱性的稀释液对精子造成的应激更小，也符合精子的生存环境[29]，且弱碱性的稀释液在精液保存的过程中可以中和精子和细菌的酸性代谢产物，从而有利于精液保存。通过分析不同稀释液对猪精液常温保存效果的影响发现，也得到弱碱性稀释液有利于精液的常温保存的相同结论。
2.3.3稀释精液pH对精子活率的影响
研究猪精液常温保存稀释粉的pH有重要的意义，因为稀释粉一方面要维持精液稳定的pH环境，避免因精子自身氧化还原反应产生的酸性物质沉积而影响整个稀释液的稳定环境，对精子造成损伤[30]。另一方面，张宝殉[31]的研究认为稀释精液处于弱碱性环境时，会抑制精子的活动使精子处于可逆性的休眠状态，从而延长精液的保存时间。本试验结果表明，当稀释精液pH处于7.0～7.3之间的稳定状态时，精子活率高于0.6，此时稀释精液可以用于人工授精。当稀释精液pH呈酸性时，精子活率迅速下降到0.6以下显著低于pH稳定状态（p<0.05）。当稀释精液pH大于7.3时精子活率逐渐下降，在之后2 d时间内精子活率显著低于pH稳定状态（p<0.05）。这与孙晓军[32]的研究结果相同，说明保存精液的适宜pH范围在7.0～
15
不同pH对猪精液常温保存效果分析
7.3之间。当稀释精液pH超出此范围，精子活率下降到0.6以下，无法用于人工授精。因此，保证稀释精液pH的稳定状态，对于延长精液有效保存时间意义重大。 2.4 结论
本实验结果表明，当稀释精液pH处于7.0～7.3之间的稳定状态时，精子活率高于0.6，此时稀释精液可以用于人工授精。当稀释精液pH超出此范围，精子活率下降到0.6以下，无法用于人工授精。稀释粉配方中调节稀释液pH的有柠檬酸、柠檬酸三钠和碳酸氢钠，维持稀释精液稳定的缓冲物质有EDTA和Tris。通过稀释粉配方的研究，配制一种可以保持稀释精液pH稳定状态的猪精液常温保存稀释粉，对于人工授精技术应用中延长精液有效保存时间有重要意义。
16