发布时间 : 星期六 文章生物化学实验讲义(最后修改版)更新完毕开始阅读
实验一：双缩脲法测蛋白质含量
一、 实验目的
了解并掌握双缩脲法测蛋白质浓度的原理和方法
二、 实验原理
具有两个或两个以上肽键（-CO-NH-）的化合物皆有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与Cu2?形成紫色配合物，此反应和两个尿素分子缩合后生成的双脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm处有最大吸收。在一定浓度范围内，蛋白质浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。
双缩脲法最常用于需要快速但不要求十分精确的测定。硫酸铵不干扰此呈色反应，但Cu2?离子容易被还原，有时会出现红色沉淀。
三、 实验器材
1． 试管1.5cm×15cm 8支。 2． 试管架：1个
3． 吸量管：5.0ml 3支、2.0ml 1支、 1.0ml 1支。 4． S22pc型分光光度计。
四、 实验试剂
1．双缩脲试剂：溶解1.50g硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC4H4O6?4H2O）于500毫升水中，在搅拌下加入300毫升10％氢氧化钠溶液，用水稀释到1升，贮存在内壁涂以石蜡的瓶中。此试剂可以长期保存，以备使用。
2．标准牛血清蛋白溶液：牛血清蛋白溶液浓度为5mg/ml,用0.05N(2g氢氧化钠溶于1升水中)氢氧化钠溶液配置.
3．未知液：可用酪蛋白配制，未知液浓度为0.5~5mg/ml。
五、 实验操作
1．标准曲线的绘制
取干净试管6支，分别加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0毫升的标准蛋白溶液（牛血清蛋白溶液），用水补足到2毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂，在室温下（15－25℃）放置30分钟，于540nm波长下用分光光度计比色测定。最后以吸光度为纵坐标，蛋白含量为横坐标绘制标准曲线,作为定量的依据。 未知样品蛋白质浓度的测定
2．吸取1毫升待测液，用水补足到2毫升，操作同前，平行做两份，于标准曲线的各管同时比色，比色后以标准曲线中查出其蛋白质浓度。
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附录：
编号
加入蛋白质的量，ml 加入水的量,ml 浓度,mg/ml 双缩脲试剂，ml 吸光度
表1 绘制标准曲线 1 2 3 0.0 0.4 0.8 2.0 1.6 1.2 0.0 1.0 2.0 4.0 4.0 4.0
4
1.2 0.8 3.0 4.0
5 1.6 0.4 4.0 4.0
6 2.0 0.0 5.0 4.0
参考资料：
[1]陈钧辉，陶力，李俊等《·生物化学实验》·第三版·北京：科学出版社，2003.4(21世纪高等院校教材)：58
六 思考题
1．如何选择未知样品的用量？
2．为什么作为标准的蛋白质必须用凯氏定氮法测定纯度？ 3．对于作为标准的蛋白质应有什么要求？
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实验二：血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
一、 实验目的
1、掌握醋酸薄膜电泳的原理及操作
2、定量测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量
二、 实验原理
采用醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋
酸纤维素，是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸脂。将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸、乙脂等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，有强渗透性，厚度约为120微米。
醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术。它具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优点。该技术已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同功酶的分离和测定等方面。目前，醋酸纤维素薄膜电泳趋向于代替纸电泳。
三、 实验试剂和器材
1． 实验试剂
（1）新鲜血清——无溶血现象
（2）巴比妥—巴比妥钠缓冲液（PH8.6,0.07M,离子强度0.06）：称取巴比妥1.66克和巴比妥钠12.76克，溶入少量蒸馏水后定容1000毫升。
（3）染色液：称取氨基黑1OB0.5克，加入蒸馏水40毫升，甲醇50毫升和冰乙酸10毫升，混匀，在具塞试剂瓶内贮存。
（4）漂洗液：取95℅乙醇45毫升，冰乙酸5毫升和蒸馏水50毫升，混匀，在具塞试剂瓶内贮存。
（5）透明液：
甲液——取冰乙酸15毫升和无水乙酸85毫升，混匀，装入试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。
乙液——取冰乙酸25毫升和无水乙酸75毫升，混匀，装入试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。
（6）0.4N氢氧化钠溶液：称取16克氢氧化钠（分析纯）用少量蒸馏水溶解后定容到1000毫升。
2． 实验器材
（1）醋酸纤维素薄膜——2厘米×8厘米（浙江黄岩曙光化工厂等处生产） （2）培养皿（直径9—10厘米） （3）点样器（自制） （4）直尺和铅笔。 （5）镊子。 （6）电泳槽。
（7）玻璃板（8厘米×12厘米）。 （8）普通滤纸。 （9）试管和试管架。
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（10）吹风机。 染色液、漂洗液和透明液应在密封的瓶子内贮存。否则，易挥发的成分蒸发，使溶液各组分配比发生改变，从而影响实验结果，在气温较高的季节，更要十分注意，特别是透明液。
四、 实验操作
1．仪器和薄膜的准备
（1）醋酸纤维素薄膜的润湿和选择：将薄膜小心地放入盛有缓冲液的培养皿内，使它漂浮在液面。若迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则表明薄膜质地均匀；若润湿时，薄膜上出现深浅不一的条纹或斑点等，则为薄厚不匀的薄膜。实验中应选用质地均匀的薄膜。因为，纤维素薄膜的质量对电泳的结果影响很大。例如，膜厚薄不匀可以造成区带歪扭不齐、各区带界限不清、背景脱色困难、实验结果难于重复等现象。
将选用的薄膜用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光泽面和无光泽面。无光泽面处点样，并向下放置。
（2）制作“滤纸桥”：剪裁尺寸合适的滤纸条。取双层附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。然后，用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为“滤纸桥”。按照同样的方法，在另一个电极槽的支架上制作相同的“滤纸桥”。它们的作用是联系醋酸纤维素薄膜和两极缓冲液之间的中间“桥梁”。
（3）平衡：用平衡装置（或自制的平衡管），使两个电极槽内缓冲液的液面彼此处于水平的状态。一般需要15—20分钟。注意，平衡后应将平衡装置的活塞关好（或除去平衡管）。此步骤不做处理。
2．点样
在薄膜无光泽面的一面点样。点样区距负极端1.5厘米处。点样时，先用点样器蘸取清水均匀地点样在滤纸上练习，再用点样器蘸取待测血清印在薄膜的点样区内。注意，应使血清均匀地分布在点样区，形成具有一定宽度、粗细均匀的直线，切不可用力过大把薄膜弄破。事先在滤纸上练习点样极为重要，掌握点样技术，这是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。
3．电泳
将已点样的薄膜无光泽面向下贴在电泳槽支架的滤纸桥上，参照图，平衡十分钟，仔细检查电泳装置的线路是否正确，然后通电。打开电源开关，调节电压和电流强度，先旋动仪器粗调旋钮，再旋动细调旋钮。调节到薄膜每厘米宽的电流强度为0 .3毫安，通电10—15分钟后，在将电压和电流强度提高到薄膜每厘米长度电压为10伏左右，薄膜每厘米宽电流强度为0.4—0.6毫安。在电泳过程中，应注意控制电压和电流强度，防止过高或偏低。待电泳区带展开约35厘米时，则关闭电源，一般通电时间约为60分钟左右。
4．染色
电泳完毕立即用镊子取出薄膜，直接浸入装有染色液的培养皿中，染色5分钟，然后，用漂洗液浸洗，每隔10分钟左右换一次漂洗液，连续更换三次，可使背景颜色脱去，将膜夹在干净的滤纸中，吸去多余的溶液。操作中，要注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。（集中倒废液。）
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