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病毒TCID50测定（组织半数感染量） 操作步骤
(1) 准备细胞
取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细 胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。
细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。 (2) 稀释待测病毒液。
A法为参考书上标准的操作方法 B法参照书将液体量减少后的结果
病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。
A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。
B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。 根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500µl，即10-1为50µl加入450µl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100µl加入900µl孵育液中。若接种8个孔，则相应增加液体量。上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。 【！此步操作注意事项：
1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。 2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。 2）此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。】 (3) 接种
取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样。【切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复4次，计算标准差。】
37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200µl继续在37℃ CO2培养箱中培养。 (4) 培养
将培养板放置于CO2培养箱。培养温度 ，培养 天。 (5) 测定结果
取出培养板，显微镜下观察细胞病变。 计算方法
1) Spearman-Karber 法
LgCCID50 /0.2ml= - （X0 - d/2 + d×∑R1/N1） X0 = 全部病变最低稀释度对数 d = 稀释因数对数
N1 = 每个稀释度所种的孔数 R1 = 病变孔数
∑ = 积和
LgCCID50 /ml = LgCCID50 /0.2ml +0.7
2) Reed-Muench法
观察CPE, 找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按计算出该病毒液的TCID50
由表看出，能使50%细胞管出现病变的病毒稀释度在10-4~10-5之间，其中间距离比例按Reed和Muench公式计算：
TCID50＝高于50%病变的病毒最高稀释度的对数＋距离比例
故能使50%细胞管发生病变的病毒稀释度为10-4.5，即TCID50为104.5倍，当病毒悬液做104.5倍稀释时，0.1ml中含1个TCID50，作其他一些实验时（如中和试验），一般常用100 TCID50/0.1ml。 3) 判定标准
细胞对照无病变，在无标准品时，应增加实验次数以减少误差。
1.病毒滴度的测定（组织细胞半数感染量—TCID50滴定） 1）流感病毒的制备
利用鸡胚尿囊腔接种法制备流感病毒，收获尿囊液，血凝试验测定病毒的存在，分装后-70℃冻存。
2）病毒的稀释
取1管冻存病毒尿囊液，1：100稀释。
第一排孔加入146μl 1：100稀释过的病毒液，然后做系列半对数稀释，使之成为10、10度重复4孔。
人流感病毒一般在胰酶存在的条件下才能感染MDCK细胞，因此病毒稀释液中需加入2μg/mlTPCK-胰酶。某些毒性很高的禽流感病毒在无胰酶存在条件下即可感染MDCK细胞，因此在测定新病毒滴度时，最好配制含有和不含有胰酶的两种稀释液，以获得最佳结果。
3）MDCK细胞的准备
使用前2天将MDCK细胞1：10传代，使之70～90%成片，处于对数生长期的细
－2
－2.5
、10、10
－3－3.5
……10。每孔含有100μl病毒液，每个稀释
－7
胞对病毒具有最大的敏感性，细胞过度生长以及代数太高（大于30代）将使细胞对病毒的敏感性降低。
弃去细胞培养液，用5毫升EDTA-胰酶洗细胞一次，然后弃去。
加4至5毫升EDTA-胰酶覆盖细胞（162cm的细胞培养瓶）37℃，5%CO2温箱中消化10～20分钟。
待细胞开始脱落时，加入5～10毫升MDCK细胞培养液，吹打分散细胞，并将细胞转入离心管，2000转离心5分钟，用PBS洗涤2次，以除去牛血清。
将细胞悬浮于1毫升病毒稀释液中，用吸管充分吹打分散细胞，再加病毒稀释液至10毫升。在细胞计数板上计数细胞是数量。
用病毒稀释液将细胞稀释成1.5×10细胞/毫升
加100μl细胞（1.5x10细胞/孔）于已稀释好病毒的微量细胞培养板中。 在37℃，5%CO2孵箱中培养18～20小时。 病毒TCID50滴度的计算：
组织培养半数感染量是病毒感染一半组织细胞时的病毒的稀释度，一般使用Reed-Muench方法计算，详细过程见表
稀释度 阳性数目（1） 10～4 10～4.5 10～5 10～5.5
1．计算各病毒稀释度阳性孔数目（1）和阴性孔数目（2） 2．计算阳性和阴性孔的累积数
阳性孔累计数由下向上累积（3）；阴性孔累积由上向下累积（4） 3．计算阳性孔的百分比：比率（5）=（3）/[(3)+（4）]； (6)=（5）×100
4 4 3 0 阴性数目 （2） 0 0 1 4 阳性数 （3） 11 7 3 0 阴性数 （4） 0 0 1 5 比率 （5） 11/11 7/7 3/4 0/5 阳性数百分比（6） 100 100 75 0 4
5
2
4．计算距离比
距离比例=（大于50%的阳性百分比-50）/（大于50%的阳性比-小于50%的阳
性百分比）=（75-50）/（75-0）=0.3
TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释对数+距离比例x稀释系数的
对数
=5+0.3×0.5=5.15 TCID50=10-5.15/100微升 100TCID50/100微升=10-3.15
100TCID50/50微升=10-3.15/2=10-3.15+0.3=10-3.15=1：1631 5．稀释系数的对数
1:10稀释为1；半对数稀释为0.5；倍比稀释为0.3；：5稀释为0.7
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