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五、简答题
1．何谓蛋白质变性，变性涉及蛋白质的哪些变化？哪些因素容易导致变性？
答：在外界因素的作用下，蛋白质原有的高度规律性的空间结构遭到破坏，一级结构不变，蛋白质的生物活性丧失的现象。称为蛋白质的变性。
变化有：
（1）生物活性丧失，蛋白质的生物活性是指蛋白质表现其生物学功能的能力，如酶的生物催化作用、蛋白质激素的代谢调节功能、抗原与抗体的反应能力、蛋白质毒素的致毒作用、血红蛋白运输氧和二氧化碳的能力等。
（2）某些理化性质的改变有溶解度降低，易形成沉淀析出，结晶能力丧失，肽链松散。 因素有：物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、剧烈震荡等；
化学因素有强酸、强碱、尿素、去污剂、重金属、三氯醋酸、浓酒精等。
2．蛋白质的二级结构的基本构象单位α-螺旋有何特征？
答：大多为右手螺旋，主要靠氢键维系，氢键的方向与长轴（主轴）基本平行，每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，螺距为0.54nm，氨基酸残基之间的距离为0.15nm，氨基酸亲水侧链伸向螺旋外侧。
3．根据氨基酸的PK值，试分别计算甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸和赖氨酸的等电点 甘氨酸pk1=2.34、pk2=9.60 丝氨酸pk1=2.21、pk2=9.15
谷氨酸pk1=2.19、pk2=4.25、pk3=9.67 赖氨酸pk1=2.18、pk2=8.95、pk3=10.53
答：甘氨酸的等电点= (pk1+pk2)/2=(2.34+9.60)/2=5.97
丝氨酸的等电点= (pk1+pk2)/2=(2.21+9.15)/2=5.68 谷氨酸的等电点= (pk1+pk2)/2=(2.19+4.25)/2=3.22 赖氨酸的等电点= (pk2+pk3)/2=(8.95+10.53)/2=9.74
说明：对于只有两个PK值的只需将两个PK值加起来除以2即可。而对于有三个PK值的情况，取PK值最近的两个数值加起来除以2即可。
4．计算含有78个氨基酸的α-螺旋的长度？
答：由于α-螺旋中每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，螺距为0.54nm，所以78个氨基酸的长度为(78÷3.6)×0.54=11.7nm。
5．蛋白质的结构有何特征？蛋白质的结构与性质之间有何关系？
答：每一种蛋白质至少都有一种构象在生理条件下是稳定的，并具有生物活性，这种构象称为蛋白质的天然构象。蛋白质的结构一般被分为4个组织层次（折叠层次），一级、二级、三级和四级结构。细分时可在二、三级之间增加超二级结构和结构域两个层次。
一级结构是指肽链中氨基酸的排列顺序。维持一级结构的主要作用力为肽键和二硫键。 二级结构是指多肽链主链本身通过氢键沿一定方向盘绕、折叠而形成的构象。基本结构单元包括：α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲。维持其结构稳定的主要作用力是主链形成的氢键。
超二级结构是指在一级序列上相邻的二级结构在三维折叠中彼此靠近并相互作用形成的组合体。有三种基本形式：αα、βαβ、ββ。
结构域是在二级结构和超二级结构的基础上形成并相对独立的三级结构局部折叠区。结
构域常常也是功能域。
三级结构是多肽链在二级结构的基础上通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠借助次级键维系使各构象单元相互配置而形成的特定构象。维持三级结构的主要作用力是疏水作用力。
四级结构是由两条或两条以上具有三级结构的多肽链聚合而成特定构象的蛋白质分子。每一条多肽链为一个亚基。亚基单独存在时不具生物学活性。
蛋白质复杂的组成和结构是其多种生物功能的基础，蛋白质一级结构决定高级结构，高级结构又决定生物功能。
7．任举一个例子来说明蛋白质的三级结构决定于氨基酸的顺序。
答：蛋白质的三维结构与其氨基酸序列有关。多肽链的二级结构决定于短程序列，三维结构主要决定于长程序列。蛋白质的氨基酸序列规定它的三维结构这一结论最直接和最有力的证据来自某些蛋白质的可逆变性实验。首先是20世纪60年代进行的牛胰核糖核酸酶（RNA酶）复性的经典实验。当天然的RNA酶在尿素或盐酸胍存在下用β-巯基乙醇处理后，分子内的4个二硫键则被断裂，紧密的球状结构伸展成松散的无规则卷曲构象，然而当用透析方法将尿素（或盐酸胍）和巯基乙醇除去后，RNA酶活性又可恢复，最后达到原来活性的95%～100%。并发现如果不事先加入尿素或盐酸胍使酶变性，则RNA酶很难在37℃和pH7的条件下被β-巯基乙醇还原。（生物化学，王镜岩，第三版，P234）
8．蛋白质化学研究中常用的试剂有下列一些：CNBr，尿素，巯基乙醇，Trypsin，过甲酸，
DNS-Cl，6M HCl，茚三酮，PITC和胰凝乳蛋白酶等，为完成下列各项试验，请回答每一项的最适试剂是什么？
a) 一个小肽的氨基酸顺序的测定（6M HCl、PITC） b) 多肽链的氨基末端的确定（DNS-Cl）
c) 一个没有二硫键的蛋白质的可逆变性（尿素）
d) 芳香族氨基酸残基的羧基一侧的肽键的水解（胰凝乳蛋白酶） e) 甲硫氨酸的羧基一侧肽键的裂解（CNBr） f) 通过氧化途径将二硫键打开（过甲酸）
9．假设下面是来自几种不同生物的丙酮酸羧化酶的191-206位的一段氨基酸序列: 生物种1:
Leu191-Gly192-Arg193-Ile194-Ala195-Gly196-Val197-Glu198-Leu199-Phe200-Ala201-Cys202-Lys203-Met204-Asn205-THr206 生物种2:
Met191-Gly192-Arg193-Ile194-Val195-Ile196-Val197-Glu198-Trp199-Phe200-Ala201-Cys202-Lys203- Gly204-Phe205-THr206 生物种3:
Val191-Ser192-Arg193-Ile194-Met195-Thr196-Leu197-Glu198-Leu199-Phe200-Ser201-Cys202-His203-Gln204-Met205-THr206 生物种4:
Val191-Ser192-Arg193-Val194-Met195-Thr196-Leu197-Glu198-Leu199-Leu200-Ser201-Cys202-Arg203-Gln204-Asn205-THr206 请回答以下问题:
⑴ 如果仅从丙酮酸羧化酶的该段序列来考虑这四种生物的亲缘关系,请问这四种生
物的亲缘关系如何?并说明理由.
答：物种1与物种2的关系近 16个氨酸酸有10个一样
物种3与物种4的关系近 16个氨基酸有12个一样
物种1 物种2 物种3 物种4
⑵ 如果已知该酶的其他序列对酶的活性影响很小,请问该酶的这段氨基酸序列种的哪
些氨基酸对保持该酶的活性可能是必不可少的?并做出解释.
答： Arg193、Glu198、Cys202、THr206这些氨基酸对保持该酶的活性可能是必不可少的。因为这四种氨基酸在这四个物种里保守性最强。出现率达100%（4/4）。 如果还有氨基酸对该酶的活性必不可少的话，应该是Arg193、Glu198、Cys202，Thr206，因为这四种氨基酸在四个物种里的为不变残基。
10.大肠杆菌含有2000种以上的蛋白质，为了分离她所表达的一个外源基因的产物并保持它
的活性，常有很多困难。但为了达到某种目的，请根据下列要求写出具体的方法。 ⑴ 利用溶解度差别进行分离。盐析
⑵ 利用蛋白质的分子大小进行分离。凝胶层析 ⑶ 根据不同电荷进行分离。离子交换层析
⑷ 对已制备的该产物的抗体进行分离。亲和层析 ⑸ 产物的浓缩。透析，冷冻干燥
⑹ 产物纯度的鉴定。电泳，N末端测定
第四章 酶