发布时间 : 星期五 文章临床样本保存及处理方式更新完毕开始阅读
临床常见的标本有血清(浆)、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、新鲜组织、石蜡切片等,这些临床标本的处理和保存方法各有不同。
临床标本的处理
血清(浆)标本
一些病原体,如乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)等的PCR检测常采用血清或血浆标本。
HBV:标本通常由医护人员采集,应注意避免溶血,如为血浆标本注意抗凝剂的选择,一般用EDTA-Na2或枸橼酸纳,不可使用肝素。标本为全血时,及时分离出血浆,提取病毒DNA进行检测。
HCV:检测RNA病毒。由于RNA极易降解,标本的制备和保存方式往往可以影响测定结果。若用血浆标本,应使用EDTA抗凝。严禁使用肝素,因其对PCR扩增有抑制作用, 且无法在核酸提取过程中去除。抗凝后6小时内分离血浆。如用血清标本,则应尽快(2小时内)分离血清进行检测,或-20oC保存。 全血标本
通常用来提取外周血单个核细胞核酸:如基因组DNA、线粒体DNA、总RNA等。 抗凝剂:一般使用EDTA-Na2、枸橼酸纳,不使用肝素。 前处理:
1)加适量的红细胞裂解液(破膜液),裂解全血中的红细胞。
2)再加适量的细胞核裂液(破核液),裂解白细胞中的细胞核,使核内DNA 释放出来。
3)然后再加SDS(十二烷基硫酸钠)等去污剂,溶解脂蛋白,解聚核蛋白。 SDS可与蛋白质结成复合物,使蛋白质变性沉淀,但SDS在以后的核酸提取过程中必须除去。 痰标本
痰属于分泌物,临床上常用作结核杆菌DNA测定样本,由于痰标本中含大量粘蛋白和
杂质,故在核酸提取时,一定要对标本进行前处理,即用4%NaOH液化,去除粘蛋白,然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等经典法提取DNA。 具体方法:
用无菌平皿取患者肺深部咳出的痰液1-3ml,
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加入4倍体积4%NaOH,摇匀,室温下放置30分钟左右液化
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取1.5ml EP管,加0.5ml 液化痰液,再加0.5ml 4%NaOH室温放10分钟
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12000 rpm,离心15分钟
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弃上清,加无菌生理盐水1 ml ,混匀,12000rpm离心5分钟
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弃上清,沉淀物用于 DNA提取
棉拭子
用PCR方法检测性病病原体时(衣原体、支原体、淋球菌、梅毒螺旋体、人乳头状瘤病毒等),临床标本一般为棉拭子。标本取材是关键,衣原体等病原体感染上皮细胞,因此取材一定要取到细胞。 具体方法:
加1ml无菌生理盐水,充分震荡混匀,12000rpm ,离心5分钟
用棉拭子取尿道分泌物或宫颈分泌物(由医护人员采集),置无菌试管或EP管内 弃上清,沉淀加无菌生理盐水1ml,打匀,12000rpm,离心5分钟 具体方法:
加1ml无菌生理盐水,充分震荡混匀,12000rpm ,离心5分钟
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用棉拭子取尿道分泌物或宫颈分泌物(由医护人员采集),置无菌试管或EP管内
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弃上清,沉淀加无菌生理盐水1ml,打匀,12000rpm,离心5分钟
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同上,重复洗涤一次
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弃上清,沉淀即可用于DNA提取
体液
体液标本,包括胸水、腹水、脑脊液、尿液等,可直接离心,取沉淀物提取核酸。 血性胸腹水,可使用红细胞裂解液处理:
加等体积红细胞裂解液,震荡混匀,置5-10分钟
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10000rpm,离心5分钟,弃上清
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可根据情况重复2-3次,沉淀物用于DNA提取
脓液
粘稠脓液:同痰标本处理,先用4%NaOH液化,再离心取沉淀提取DNA。 水样脓液:直接离心,沉淀用生理盐水洗2-3次后用于DNA提取。 组织
组织有新鲜组织和石蜡切片。
新鲜组织的处理步骤:先用生理盐水洗二次,然后将其捣碎或剪碎(用眼科剪),加蛋白酶K消化后提取核酸
石蜡切片用于核酸提取,需先用二甲苯脱蜡,再用蛋白酶K消化后进行DNA提取。
标本的保存
血清(浆)
HBV:分离出的血清(浆)如不立即提取核酸,保存于-20℃待检。 HCV:尽快分离血清(浆), 如不立即提取RNA,保存于-20℃待检。
长期保存:吸取200μl血清,加20u RNasin(RNA酶抑制剂),保存于-70℃。
已发出结果报告的标本应及时转移至冰箱保存,并由专人负责管理,保存1-2周(时间长短根据报告单上的承诺而定)。 全血标本
全血标本如用于DNA提取,可4℃下短期保存(数天),时间长易降解,如用于RNA检测,应在取血后尽快提取RNA。
最好将DNA或RNA提取后,置-70℃保存。 痰
液化的痰标本如不立即用于核酸提取,可保存于-20℃。
处理后的棉拭子、体液、脓液如不立即用于核酸提取,可保存于-20℃。 组织
新鲜组织最好保存于50%乙醇中,具体方法:先用生理盐水将组织洗一次,切成小块,加入适量生理盐水,然后边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%,这样固定的组织标本室温下可保存数日,4℃可保存6年。
总而言之,标本的保存及适当的预处理对核酸模板的成功提取具有决定性作用。要强调的是,所有用于上述处理的容器如试管或离心管,均应在使用前压灭菌。