发布时间 : 星期一 文章常用液相色谱柱的规范化使用与保养标准操作规程更新完毕开始阅读
****** GMP文件 文件题目 常用液相色谱柱的规范化使用与保养标准操作规程 文件编号 及版本号 SOP-QC-000-00 2.2.1.1若在正相条件下使用： 2.2.1.1.1老化
用正己烷-乙腈（99：1）以0.5ml/min的流速冲洗约50倍柱体积。 2.2.1.1.2使用
2.2.1.1.2.1根据待分析用正相流动相极性选用极性相近的氯仿或二氯甲烷以相同的流速冲洗约10倍柱体积。
2.2.1.1.2.2用正相流动相平衡1h以上，确保柱压控制在6000Psi以内，以防止柱头塌陷。待基线平稳后，进样检测。如果要使用的流动相中含有缓冲盐类，在使用流动相平衡之前，先用不含缓冲
盐的同比例流动相过渡，冲洗约10倍柱体积，避免缓冲盐在分析柱内析出。
2.2.1.1.3维护与保养
2.2.1.1.3.1分析完毕，用异丙醇，以0.5ml/min流速冲洗色谱柱约30倍柱体积；再用甲醇，以1ml/min流速冲洗色谱柱约10倍柱体积；再用异丙醇，以0.5ml/min流速冲洗色谱柱约10倍柱体积。若使用的分析用流动相中含有缓冲盐类，分析完毕需先用不含缓冲盐的同比例流动相冲洗约30倍柱体积，再按上述方法冲洗。
2.2.1.1.3.2净化完毕，若次日不再使用，选择柱说明书中保存条件规定的保存溶剂[一般用正己烷-乙腈（99：1）]冲洗10倍柱体积以上，可取下色谱柱，用封头螺丝密封，交色谱柱管理人员入库保存于防尘环境下，备案。
2.2.1.1.3.3重新在正相条件下使用时，重复上述过程即可，时间可适当减少一半左右。 2.2.1.1.4常见故障处理与色谱柱再生
2.2.1.1.4.1在正相条件下使用时，故障率较低。但要注意不可进样含有醛基、羰基的化合物，不可用于还原糖的分析；流动相要彻底脱气，并不得含有羰基化合物和过氧化物（质量较差的乙醚、四氢呋喃等溶剂中含有少量）。任何时候更换流动相时都要确保新流动相与柱子原保存液可互溶，若不互溶，必需用异丙醇过渡。
2.2.1.1.4.2当使用氨基柱进行酸性物质分析时，酸性物质溶液有质子存在，会使略带负电荷的氨基官能团质子化，导致使用一段时间后被测成分保留性质有所改变或柱效下降。这时，建议按如下方法处理：首先用异丙醇，以0.5ml/min流速，冲洗约50倍柱体积；然后用甲醇，以0.5ml/min流速，冲洗约50倍柱体积；再用异丙醇，以0.5ml/min流速，冲洗约10倍柱体积过渡，回到平常 使用的正相流动相平衡2h，进样检测即可。
2.2.1.1.4.3若上述方法不凑效，可尝试按以下程序冲洗与再生：
首先用含0.5%～1.0％NH3的50%乙腈-50%水溶液，以1.0ml/min流速冲洗该柱约5～10倍柱体
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****** GMP文件 文件题目 常用液相色谱柱的规范化使用与保养标准操作规程 文件编号 及版本号 SOP-QC-000-00 积；然后用不含NH3的50%乙腈-50%水溶液，以1.0ml/min流速冲洗该柱约5～10倍柱体积以洗去多余NH3；再用添加少许NH3（如0.1％）的酸性分析物的流动相平衡2h左右，进样检测即可。
2.2.1.2在反相条件下使用：操作和维护与C18柱基本相同，但需注意，冲洗溶剂中有机相不能低于10%。
2.2.1.2.1老化
用正己烷-乙腈（99：1）以0.5ml/min的流速冲洗约30倍柱体积。 2.2.1.2.2使用
依次以0.5ml/min的流速，用等量的氯仿→异丙醇→甲醇→甲醇-水（50：50）分别冲洗柱子约10倍柱体积；再以0.5ml/min的流速，用pH11.0以下的氢氧化钠溶液冲洗柱子约30倍柱体积（注意：pH值切不可超过11.0）；立即用水以0.5ml/min的流速冲洗柱子约30倍柱体积；最后换成反相流动相平衡1h以上，待基线平稳，进样检测。（备注：若要使用的反相流动相中含有缓冲盐类，在 用反相流动相平衡之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，冲洗约10倍柱体积，避免 缓冲盐在分析柱内析出。在反相条件下使用时，要特别注意控制pH值范围及流动相中水的比例，pH值越低越易发生键合相水解，流动相中水的比例越高也越易发生键合相水解。最理想的pH范围在pH 3.0-7.0，决不允许超过11.0。）
2.2.1.2.3维护与保养
2.2.1.2.3.1反相条件下使用完毕，净化处理程序同C18柱,但需注意，冲洗溶剂中有机相不能低于10%。
2.2.1.2.3.2净化完毕，先用甲醇以0.5ml/min的流速冲洗柱子约10倍柱体积；然后用异丙醇以0.5ml/min的流速冲洗柱子约10倍柱体积；最后用色谱柱说明书中规定的正相保存溶剂[一般用正己烷-乙腈（99：1）]以1ml/min冲洗约10倍柱体积。若次日不再使用，选择柱说明书中保存条件规定的保存溶剂冲洗10倍柱体积以上，可取下色谱柱，用封头螺丝密封，交色谱柱管理人员入库保存于防尘环境下，备案。
2.2.1.2.4常见故障处理与色谱柱再生
在反相条件下使用时，-NH2键会水解，尤其是在该柱子pH范围以外，在极端酸性和碱性条件下柱效会下降很快，所以故障率较高。若出现柱压增高柱效降低等情况，建议采用如下方法处理：
2.2.1.2.4.1若流动相含有缓冲盐，先以流动相比例的水-有机溶剂，以检测分析时同流速冲洗约30倍柱体积；再用纯甲醇，以1.0ml/min流速冲洗约50倍柱体积；然后用异丙醇，以0.5ml/min流速冲洗约10倍柱体积过渡；再用二氯甲烷以0.6ml/min流速冲洗色谱柱约10倍柱体积；再用异丙醇以0.5ml/min流速冲洗约10倍柱体积过渡回到甲醇条件下，以1.0ml/min流速冲洗约10倍柱 体积，密封保存或用流动相平衡2h左右（若流动相含有缓冲盐，需先用与流动相同比例的水-有机相以1.0ml/min流速冲洗约30min），进样检测即可。
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****** GMP文件 文件题目 常用液相色谱柱的规范化使用与保养标准操作规程 文件编号 及版本号 SOP-QC-000-00 2.2.1.2.4.2若上述方法不凑效，可尝试如下程序冲洗与再生：95％水-5％乙腈，以1.0ml/min流速冲洗约10倍柱体积；THF（四氢呋喃），以0.6ml/min流速冲洗约10倍柱体积；95％乙腈-5％水以1.0ml/min流速冲洗约10倍柱体积；保持95％乙腈-5％水，以低流速0.2-0.5mL/min冲洗过夜；流动相平衡2h（若流动相含有缓冲盐，需先用与流动相同比例的水-有机相以1.0ml/min流速冲洗约30min），进样检测即可。
2.3.亲水性色谱柱
亲水性色谱是正相色谱的一个变种。 HILIC HPLC Column亲水性色谱柱是以超纯硅胶为基质， 表面键合有二氧化硅(silica，弱酸性)，氰基（cyano，弱酸性）, 二羟基（diol，中性），二丙基乙酰胺基（valpromide，弱碱性），丙基酰胺基（Venusil，弱碱性），氨基（amino，弱碱性）, 吡啶基（Pyridine，弱碱性），咪唑基（Imidazole，弱碱性）等亲水基团的极性固定相。可用于正相、反相和亲水液相色谱，是代替氨基柱和硅胶柱的最佳选择。与传统硅胶柱相比，具有更好的重现性和柱寿命。
HILIC HPLC Column亲水性色谱柱分离机理目前还存在着争议，主要包括以下三个方面：分配机理、离子交换、偶极-偶极相互作用。而更多的试验现象则表明HILIC的保留机理包含氢键作用、偶
极作用和静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来。
HILIC HPLC Column亲水性色谱柱适合于分离在反相色谱柱上不保留的极性化合物，尤其是对强极性碱性化合物的保留能力强，因此，其成为研究药物代谢、药物发现和组合化学科学的首选，尤其适用于LC-MS及LC-ELSD。通常主要用于分离水溶性极强的极性化合物，如有机酸（eg.水杨酸）、糖类等。其检测灵敏度可比使用反相色谱柱提高10～1000倍。其使用与保养基本同正相色谱柱。
2.3.1老化
采用水-乙腈（50:50）以0.4～0.8ml/min流速，冲洗至少50倍柱体积进行一次预平衡；再用水-乙腈（30:70）以检测条件流速，冲洗约10倍柱体积进行二次预平衡。
2.3.2 使用
2.3.2.1用初始流动相条件按检测方法冲洗约20倍柱体积进行初始平衡； 2.3.2.2然后进样1至2针，进行进样平衡；
2.3.2.3再用初始流动相条件按检测方法冲洗约20倍柱体积，进行最终平衡； 2.3.2.4进样检测。 2.3.3维护与保养
2.3.3.1分析完毕后，首先用水-乙腈 (90:10) 以0.4～0.8ml/min流速，冲洗约30倍柱体积（洗出强极性物质）；再用水-乙腈（50:50）以0.4～0.8ml/min流速，冲洗至少50倍柱体积（洗出中等极性物质）；再用水-乙腈（10:90）以0.4～0.8ml/min流速，冲洗至少30倍柱体积（洗出弱极性物质及饱和色谱柱）；若次日不再使用，选择柱说明书中保存条件规定的保存溶剂冲洗10倍柱体积以
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****** GMP文件 文件题目 常用液相色谱柱的规范化使用与保养标准操作规程 文件编号 及版本号 SOP-QC-000-00 上，可取下色谱柱，用封头螺丝密封，交色谱柱管理人员入库保存于防尘环境下，备案。（保存溶剂多为90%乙腈溶液，多保存于10℃左右环境中）。
2.3.3.2特别注意：
2.3.3.2.1进样检测时，必需要保证流动相中至少含有40%左右的有机相（以乙腈多用）。流动相中若需使用添加剂时，一般避免添加离子对试剂，推荐使用醋酸铵、甲酸铵以提高进样重现性，但要谨慎使用磷酸盐等无机盐，以避免沉淀在柱内析出（因其在较高浓度有机溶剂下难溶）。可以使用但一般不建议使用甲酸等低分子量低黏性酸，且浓度多用0.2%，最好不要使用磷酸（因其黏度较大，易固定保留在固定相上，且易导致保留时间漂移）。流动相pH稳定范围一般为1.5-8.0。
2.3.3.2.2梯度洗脱时，不允许从100%有机相（因为100%的乙腈可能不利于HILIC色谱柱中亲水基团部分键合相的伸展，使得保留性能下降。）到100%水相，必需保证至少含有40%左右的有机相（以乙腈多用）。由于HILIC柱的固定相是亲水性的，且在一定pH值范围内是带电荷的，而HILIC的流动相是作为固定相的一部分来起作用的，因此必需在流动相中保持一定量的水相（比例保持在5%～60%）。
2.3.3.2.3等度洗脱时应注意避开流动相比例拐点。一般情况下，使用HILIC柱时，有机相比例增加，保留时间会延长，但HILIC柱在60%左右比例的有机相时会有一个拐点，即随有机相比例增高，保留时间缩短。具体的拐点比例与生产厂商的填料有关，一般在50%-60%比例的有机相之间。
2.3.3.2.4 过滤样品溶液时，避免使用带有橡胶密封圈的针管，而应使用玻璃针筒及不锈钢针。样品溶解溶剂最好是100%的有机相（但往往无法实现），最好不用纯水，而应该保证有机溶剂至少40%的比例。
2.3.3.2.5 应根据色谱柱型号选择进样体积，一般：5～50 μL for 4.6 mm i.d. column；0.5～5 μL for 2.1 mm i.d. column。
2.3.3.3.6 进样器与进样针及进样间隔的清洗溶液，推荐使用含有95%有机相的水溶液或与流动相组成及极性相似的混合溶液（不含缓冲盐及其他试剂）。
2.3.3.3.7 HILIC色谱柱的最佳流速范围是0.4～0.8ml/min，但需根据色谱柱型号选择，一般为：1.0 mL/min for 4.6 mm i.d. column ；0.2 mL/min for 2.1 mm i.d. column 。
2.3.3.3.8柱温无特殊要求，但不允许高于色谱柱说明书规定的最高耐受温度。 2.3.4常见故障处理与色谱柱再生
一般同正相色谱柱，可参考氨基柱的处理方法；亦可根据色谱柱的可能污染情况，合理选择溶剂冲洗与再生。
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