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血浆蛋白结合率（plasma protein binding, PPB）的测定方法
文章来源vx公众号DMPK
药物在吸收入血后以游离态和结合态两种形式存在，其中PPB即表示与血浆蛋白结合形成结合态药物的比例。游离药物假说认为仅有游离态的药物才能扩散透过生物膜，到达靶部位发挥药效；另外游离药物的比例还显著影响药物分布、代谢和排泄的过程，PPB与药物的诸多药理性质均有关。下文将就PPB的基本原理和测定方法进行阐述。
1 结合蛋白类型
血浆蛋白主要作为载体负责各类外源性和内源性分子在循环系统内的转运。其中参与小分子药物结合的主要有白蛋白、α-1-酸性糖蛋白（AAG）、球蛋白和脂蛋白，主要以白蛋白和AAG为主。药物与蛋白的结合强弱主要与药物-蛋白亲和力、蛋白丰度相关。 1.1 人血清白蛋白（HSA）
HSA为非糖基化单体蛋白，由585个氨基酸、17二硫化物和1个半胱氨酸残基组成其在体内浓度约为500-700μM，为人体血浆中含量最高的蛋白类型，其除了作为各类物质转运载体，亦辅助维持血液渗透压和pH值。药物与HSA的非共价结合由小分子药物与蛋白氨基酸残基的高亲和性结合介导形成，可帮助药物躲过肾脏排泄、肝脏代谢和血流作用。酸性化合物更倾向结合于HSA，碱性化合物更易于AAG结合。 1.2 α-1-酸性糖蛋白（AAG）
AAG为血浆中药物结合相关的另一重要蛋白，其具有高度糖基化的特点，由此形成大量的负电荷，其等电点约为2.7-3.2，更倾向与碱性化合物结合。目前AAG的生理功能主要与免疫抑制、免疫调节、血小板聚集、淋巴细胞增殖和IL-2分泌等过程相关，正常生理条件下血清中AAG的浓度约为9-23μM，但是其表达水平会随着免疫或炎症反应的发生而升高。药物-AAG结合过程主要与AAG的浓度、AAG多态性、多糖异质性和pH等因素相关，其中AAG的浓度影响最为明显。疾病状态下炎症和免疫反应的发生通过影响PPB进而影响药物PK特征，尤其在化合物与AAG的结合能力较强的条件下。
2 PPB的测定方法
目前常用于PPB测定的方法主要包括平衡透析法（equilibrium dialysis, ED）、超滤法（ultrafiltration, UF）、超速离心法（ultracentrifugation, UC）和其他不常用的方法。 2.1 平衡透析法（ED）
如下图，ED采用半透膜分割的两隔室装置进行测定，一侧加入含药的蛋白溶液，另一侧加入空白的缓冲液，此条件下仅游离药物可以自由穿过半渗透膜，孵育一段时间，两侧达到平衡后两侧的游离药物浓度相等，结合态的药物仍然停留于蛋白溶液侧，通过测定两侧的药物浓度即可算得PPB。震荡的条件可以加速平衡的过程，高分子量和结合能力强的化合物需要较长的平衡时间。
平衡透析法目前是最常用的方法，但也存在一定的缺陷，如初始平衡状态的改变、非特异性结合、体积变换、Donnan效应和蛋白渗漏等。
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初始平衡状态的改变是指当游离药物穿过半透膜时会形成新的游离态-结合态的平衡，由此造成试验设置浓度与实际平衡浓度的差异，对于PPB存在浓度依赖特性的化合物可能造成结果的偏差。
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非特异性结合是指药物与半渗透膜等试验装置的结合，可能造成游离药物浓度的低估，进而影响试验结果。通常采用聚四氟乙烯（Teflon）制造的试验装置以降低非特异性结合的影响。如果非特异性结合现象比较严重建议采用超速离心法。
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体积转换是指液体在胶体渗透压的作用下从buffer侧移动至蛋白侧，由此稀释蛋白浓度对结合率较低的化合物试验结果造成影响。当液体转换比例低于10%时该效应几乎忽略，孵育时间超过4h可能会加剧该效应，可以通过在buffer侧加入右旋糖酐以平衡两侧渗透压。
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Donnan效应是指吉布斯-唐南效应，是指带电粒子不通过半透膜而产生不均匀的电荷，使两侧粒子浓度不一致。尤其对于高离子化且低蛋白结合的药物，该效应最为明显，该效应可以通过增加buffer侧电解质的浓度来弱化。
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当半透膜完整性出现问题时会发生蛋白渗漏现象，对于高蛋白结合率化合物，由此会造成游离药物比例的显著高估，尤其在孵育时间过长时易发生。 2.2 超滤法（UF）
超滤法与平衡透析法类似，同样采用半透膜分隔的两隔室装置进行测定。含药蛋白溶液加入上层隔室，在外界压力或者离心条件快速的使游离药物运动至下方buffer侧，通过测定两侧化合物浓度计算PPB。该方法相对于ED优势在于其试验时间短，可显著减少酯酶代谢、蛋白稀释和蛋白渗漏造成的试验偏差。而该方法最大的劣势为药物非非特异性结合效应较明显，尤其对于高脂溶性化合物，该类情况下可以采用测定buffer中结合率进行试验作为基础对照，考察无蛋白条件下化合物的结合情况，校正正式试验结果。在进行中性和碱性化合物测定时，采用吐温-80预处理半透膜；酸性化合物时，用苯扎氯铵预处理可以降低非特异性结合。 2.3 超速离心法（UC）
该方法的最大特点为利用非常高的离心力（625000g）来分离游离态和结合态药物。如图所示，离心之后结合态的药物与血浆蛋白一起分布于底层，中间层即为游离药物分布层，最上层为极低密度的脂蛋白和乳糜微粒漂浮物。通过测定中间层和离心前初始药物浓度即可算得PPB。该方法成本相对较高，但具有时间短、样品需求量小、非特异性吸附效应弱和消除膜相关问题的优势。UC另外缺陷为在超速离心的作用下可能改变化合物的结合平衡。