微核正式报告

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利用花露水对蚕豆(Vicia faba)根尖细胞微核的诱导及观察

( 焦锦花 1020212128 生物技术1011班 )

组员名单:葛笑、孙晓玮、周晓杰、徐中洋、李亚峰、程石、蒋沈琳、焦锦花 一、实验目的:

1、了解微核测试的原理和毒理遗传学在实际生活中的应用范围及意义 2、学习蚕豆根尖的微核测试技术并掌握其操作方法 3、探究花露水对微核的诱导作用 4、进行小组合作,掌握设计实验基本能力 二、实验原理:

微核简称(MCN),是真核生物细胞中的一种异常结构,往往是细

胞经辐射或化学药物的作用而产生。利用蚕豆根尖作为实验材料进行微核测试, 可准确的显示各种处理诱发畸变的效果,并可于污染程度的监测。

花露水包含少量劣质香精和75%左右的酒精,还有一种叫“伊默宁”的成分, 而花露水芬芳剂成分部分有毒。

本实验通过用实验室蒸馏水(对照组)、重铬酸钾(阳性对照)、和一定范围内不同浓度的花露水处理蚕豆根尖,通过观察计数后计算蚕豆根尖细胞微核千分率得出花露水的细胞毒性效应。

本实验即运用蚕豆根尖微核实验检测,研究花露水对蚕豆根尖微核诱导的作用,进而为花露水对人体以及环境的影响提供一定的理论参考 三、实验材料和主要试剂

蚕豆种子、花露水:用蒸馏水配制成25%、50%、75%梯度的溶液及原液、卡诺固定液(无水酒精:醋酸=3:1)、改良石炭酸品红、重铬酸钾溶液 四、实验过程

1、催芽:将实验用蚕豆种子按需要量放入盛有蒸馏水的烧杯中,在25℃下浸泡8小时。种子吸胀后 ,放入培养皿中,用棉花保持湿度,在25℃温箱中催芽三天浸种催芽

2.花露水处理:每一处理选取3粒初生根良好、根长较一致的种子。将蚕豆不定根置于不同浓度(25%、50%、75% 溶液及原液)的花露水培养6~8小时,第二组用蒸馏水处理作对照,第三组用重铬酸钾作阳性对照。

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3.根尖细胞恢复培养:处理后的根尖用蒸馏水浸洗三次,每次2~3分钟。洗净后置入培养皿,25℃下恢复培养24小时

组别 1 2 3 4 5 6 被检测液 3个根尖分生组织区微核数 微核率(MCN‰) 蒸馏水(阴性对照组) 25%花露水 50%花露水 75%花露水 花露水原液 重铬酸钾(阳性对照组) 5,4,5 7,6,8 7,9,11 8,10,10 8,7,9 8,9,12 14.00‰ 21.00‰ 27.00‰ 28‰ 24‰ 29‰ 4.根尖细胞固定:剪取0.5~lcm长根尖,蒸馏水清洗后,放入卡诺固定液中固定8h。

5.制片(解离、染色、压片):解离10min→染色10min→压片→镜检观察。 五、实验结果

Ps:本页第三行到第六行 六、结果分析

1.在一定浓度范围内(75%内),蚕豆根尖细胞微核率随花露水含量提高而提高。(花露水含量越高,其对细胞染色体和DNA的损伤越大。)

2.当花露水含量达到一定程度后(75%~100%),细胞微核率出现下降。(诱导物含量过高、毒性过强,导致细胞核死亡或变形,或遗传物质受到破坏,蚕豆根尖无法继续分裂,从而导致细胞微核率降低)

3.蒸馏水培养的蚕豆也会发生自身地畸变,但是比率较小

4.在浓度大于75%后,也可能是酒精挥发的不够,还有大量酒精残余,导致酒精含量过高,限制了根尖细胞的分裂。实验条件允许的话,我们可以对上述想法进行验证。

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七、误差分析

1.处理时间较短,仅6小时,因此微核率较小;

2.镜检时,由于细胞数量较多,视野较小,在计数上也存在一定误差。 八、相关问题回答

1、为什么选用蚕豆根尖作为实验材料?

答:蚕豆是一种很好的细胞遗传学研究材料,蚕豆体细胞的染色体仅有6对,且细胞比较大,极易观察,而且蚕豆根尖细胞周期中大部分时间处于对诱变剂敏感的间期,便于遗传毒性检测试验,精确度也比较高。所以在遗传学、环境毒理学检测中被广泛运用,蚕豆根尖微核实验是国际上常用的遗传毒理学检测试验。

2.在蚕豆根尖细胞的微核测试中,为什么要进行恢复培养?

答:蚕豆根尖细胞经诱变剂处理后,发生DNA损伤,如果细胞不分裂的话,还是保持原先的单细胞核状态,就不会形成微核;只有经过恢复培养,经有丝分裂,DNA损伤才能得以表现出来,而这种表现就是微核的形成。所以说要观察到微核,就必须经过恢复培养。

3、如何减小花露水不必要成分对于微核诱导的影响?

答:为了减小酒精对实验结果的影响,我们利用酒精的挥发作用将花露水敞开暴露于空气中,使其尽量挥发。

4、生物实验设计中为什么要设立阴性对照、阳性对照?

答:阴性对照的目的是排除假阳性,阴性对照就是一个确定肯定已知是阴性的东西,如果结果出来这个样本显示阳性了,说明实验有问题。

阳性对照的目的是排除假阴性,阳性对照就是一个确定肯定已知是阳性的东西,如果结果出来这个样本测不出阳性反应,说明实验有问题。

空白有的时候可以当作是一种阴性对照。空白的特别意义在于测定实验的背景噪声。也就是说,空白样本被测得到的数值,告诉你未知样本的读数当中,有多少数值是背景,多少是真实特异性的反应所得。 九、实验总结

实验时间要安排合理,每次制片的数目要量力而行。根尖制片后长时间放置容易干燥,无法观察,实验小组成员之间要学会交流沟通,妥善安排

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实验进度。第一轮实验的时候压片技术很差,做到后来大家的技能都有所提高,大家还需要磨练。从这次试验中我们也都体会到了团队和作能力和团队沟通能力的重要性。 十、实验方案的改进建议

1、改变原先酒精挥发的方法,采用高温蒸发除去酒精的影响。

2、可以根据花露水浓度梯度进行相应浓度的酒精对照组。

3、对比含有酒精和将酒精蒸发掉的花露水对于微核诱导的微核率,探究酒精是否是主要的影响因素。

4、将一次性的花露水诱导换成多次短时间的诱导,观察蚕豆的微核率是否有差异。

5、用不同种类,不同品牌的花露水进行微核率的比较。 十一、还存在的疑惑

1、在进行小组探究的过程中,有讨论过为什么对蚕豆微核诱导的实验结果

对于人是否实用或者有一定的关联性的问题,但是对于确切的联系,我们还不是很清楚,毕竟植物和人还是有很大差别的。

2、一次大剂量长时间的诱导和多次小剂量短时间的累加诱导,结果一样

么?

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