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七、思考题
1、RNA的提取制备方法主要有哪些？
参考答案：由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。
实验八 苔黑酚法测定核酸含量
一、实验目的
1、掌握苔黑酚法测定RNA含量的基本原理和具体方法。 2、掌握标准曲线定量分析方法 3、熟练使用分光光度计 二、实验原理
RNA含量测定除可用紫外吸收法及定磷法外，常用苔黑酚法测定。其反应原理是：当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3,5-二羟基甲苯（苔黑酚，又名地衣酚orcinol）反应，在Fe 3+或Cu 2+催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在670nm处有最大吸收。RNA浓度在20~250μg·ml-1范围内，光吸收与RNA浓度成正比。 三、实验用品 1．仪器
分光光度计（配玻璃比色皿、擦镜纸、注明废液回收的具塞广口瓶、洗瓶）；水浴锅。 2. 玻璃器皿
1 mL、2 mL刻度吸管各2支（配合适大小吸耳球）；10 mL具塞具刻度试管10支（应干净干燥，放到试管架上）；100 mL烧杯2个，10 mL量筒1个；玻璃棒1根；长胶头滴管1根。此部分为每组所用，放置各实验台上。 3．试剂：（1）~（2）由实验员配制，贴好标签。
（1）RNA标准溶液：取酵母RNA纯品配成100微克/毫升的溶液。配制时先用蒸馏水溶解，若不溶可滴加浓氨水，调pH=7.0，再定容。
（2）苔黑酚试剂：先配0.1%三氯化铁的浓盐酸（分析纯）溶液，实验前用此溶液作为溶剂配制0.1%苔黑酚溶液，临用时配制。
（3）样品待测液：由实验七所得，用时根据需要进行稀释。 四、操作步骤：
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1．标准曲线的制作
取6支干净烘干试管，按下表编号及加入试剂。
表 制作标准曲线的试剂量 管 号 RNA标准液( mL ) 蒸馏水( mL ) 苔黑酚试剂( mL ) 核酸量( μg ) 0 0 2.0 2.0 0 1 0.4 1.6 2.0 40 2 0.8 1.2 2.0 80 3 1.2 0.8 2.0 120 4 1.6 0.4 2.0 160 5 2.0 0 2.0 200 加毕混匀，置沸水浴加热45min，取出冷却，以零号管作对照，于670nm波长处测定光吸收值。以RNA量为横坐标，光吸收为纵坐标作图，绘制标准曲线。 2．样品的测定
取两支试管，各加入2.0ml样品液，再加2.0ml苔黑酚试剂。如前述1进行测定。根据标准曲线求得RNA含量 ：
w=m1 / m2?100%
式中：w---表示RNA含量
m1-----从标准曲线查得RNA量, μg . m2------样品重( g ).
v1------提取物总体积（ml） v2------测定时样品体积（ml）
若样品溶液经过稀释，则最后结果要乘以稀释倍数。 五、结果与讨论： 1．绘制出标准曲线 2．RNA含量的计算 六、注意事项
（1）样品中蛋白质含量较高时，应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定。 （2）本法特异性较差，凡属戊糖均有反应。微量DNA无影响，较多DNA存在时，亦有干扰作用。如在试剂中加入适量CuCl2·2H2O可减少DNA的干扰，甚至某些已糖在持续加热后生成的羟甲基糖醛也能与地衣酚反应，产生显色复合物。此外，利用RNA和DNA显色复合物的最大光吸收不同，且在不同时间显示最大色度加以区分。反应2min后，DNA在600nm呈现最大光吸收，而RNA则在反应15min后，在670nm下呈现最大光吸收。 七、思考题
1、测定核酸含量的常用方法有哪些？优缺点如何？
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