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《生物化学实验》内容
课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个
适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳
一、实验目标及基本要求
生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事求是的科学态度。 二、实验内容 序 号 1 2 3 4 5 6 7 8 实 验 项 目 植物组织中可溶性总糖的提取 蒽酮比色定糖法 卵磷脂的提取和鉴定 皂化价的测定 牛乳中酪蛋白的制备 蛋白质浓度测定（考马斯亮蓝结合法） 酵母RNA的提取 RNA的定量测定（苔黑酚法） 学 时 4 4 4 4 4 4 4 4 实 验 要 求 必 修 必 修 必 修 必 修 必 修 必 修 必 修 必 修 实 验 类 别 验证性实验 验证性实验 验证性实验 验证性实验 验证性实验 验证性实验 验证性实验 验证性实验 三、成绩 包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求
（1） 实验过程中同组人可以配合进行；
（2） 实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据； （3） 实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4） 对实验结果进行简单的分析.
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实验一 植物组织中可溶性总糖的提取
一、实验目的
1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。
3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理
可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体内可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品
1. 仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电加热板或电炉或电热套或水浴锅均可。可共用。
2. 玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻璃棒1根；100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）；不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3. 药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。
4. 其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若干。每个洗手池常规配置烧杯刷、毛巾、洗手液。 四、实验操作
取新鲜植物叶片，洗净表面污物，用滤纸吸去表面水分。称取0.5g，剪碎，加入5～10ml蒸馏水，在研钵中磨成均浆，转入锥形瓶中，用蒸馏水少量多次冲洗研钵，洗出液也转入锥形瓶中，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，提取液冷却后过滤到100ml容量瓶中，同法残渣再提取2~3次，将提取液合并至容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。贴好标签，保存至冰箱中，用于实验二。 五、实验结果与讨论
1、观察产品颜色是否与理论相符，若不符合，分析原因。 2、结合实验二结果计算含量 六、实验注意事项
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（1） 若有干扰，可滴加饱和中性醋酸铅以除去溶液中的蛋白质，乙醇沉淀
除去部分醇溶性杂质，若色素较多可脱脂。
（2） 加热时应小心，避免灼伤皮肤。 七、思考题
1、可溶性糖在植物物质代谢中的作用。 2、用水提取的糖类有哪些？
实验二 蒽酮比色法测定可溶性总糖含量
一、实验目的
1、掌握蒽酮比色法测定可溶性总糖的原理和方法 2、掌握标准曲线的绘制 3、掌握分光光度计的使用方法 二、实验原理
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等(因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应)，所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ，故在此波长下进行比色。
三、实验材料、试剂与仪器设备 1、仪器
分光光度计（配玻璃比色皿、擦镜纸、注明废液回收的具塞广口瓶、洗瓶）；电子天平（配称量纸）；离心机（配离心管），恒温水浴锅。 2、玻璃器皿
0.5mL、1 mL、5 mL刻度吸管各2支（配合适大小吸耳球）；10 mL具塞具刻度试管10支（应干净干燥，放到试管架上）；100 mL烧杯2个；10 mL量筒1个；玻璃棒1根；长胶头滴管1根。此部分为每组所用，放置各实验台上。 3、试剂：（1）~（3）由实验员配制，贴好标签 （1）80 %乙醇
（2）葡萄糖标准溶液( 100 μg/mL )：准确称取 100 mg 分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至 1000 mL。
（3）蒽酮试剂：称取 1.0 g 蒽酮，溶于 80% 浓硫酸(将 98% 浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中) 1000 mL中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用 2 ~ 3 周。
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（4）样品贮备液：学生实验一所得可溶性总糖提取物水溶液。 四、实验步骤 1、标准曲线制作
取6支试管，从0 ~ 5分别编号，按下表加入各试剂：
表 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量
管 号 100 μg/mL 葡萄糖溶液( mL ) 蒸馏水( mL ) 蒽酮试剂( mL ) 葡萄糖量( μg ) 1.0 5.0 0 0.8 5.0 20 0.6 5.0 40 0.4 5.0 60 0.2 5.0 80 0 5.0 100 0 0 1 0.2 2 0.4 3 0.6 4 0.8 5 1.0 将各管快速摇动混匀后在沸水浴中煮 10 min，取出冷却，在 620 nm 波长下用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量( μg )为横坐标绘制标准曲线。 2、样品测定
将样品贮备液用蒸馏水稀释到合适范围，取该溶液 1.0 mL 加蒽酮试剂 5 mL，同以上操作显色测定光密度。重复 3 次。 按照下式计算可溶性总糖的含量：
w=n?m1 / m2?100%
式中：w---表示总糖含量
n---稀释倍数
m1-----从标准曲线查得糖量, μg . m2------样品重( g ).
v1------提取物总体积（ml） v2------测定时样品体积（ml）
五、结果与讨论：
1．绘制出标准曲线 2．含量的计算 六、实验注意事项
（1）加浓H2SO4时应缓慢加入，以免产生大量热量而爆沸，灼伤皮肤，如出现上述情况，应迅速用自来水冲洗。 （2）水浴加热时应打开试管塞。 七、思考题
1、植物组织中糖的测定方法还有哪些？举例说明其原理和优缺点？ 2、制作标准曲线时应注意哪些问题？
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