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第六章 常用基因分析方法
授课时数：2学时 教学目标
1、掌握核酸分子杂交的原理 2、掌握PCR技术的原理及其应用 3、了解核酸提取的原理及常用材料 教学重难点
1、核酸分子杂交的原理 2、PCR技术的原理及其应用 授课内容
第六章 常用基因分析方法
一、核酸提取
基因分析的材料是核酸，即DNA或RNA。在基因分析之前，首先必须获得基因分析的材料。
（一）DNA提取：
1、提取DNA的常用材料：DNA存在于细胞核中，由于同一个体的所有体细胞中所含的DNA相同，因此，在提取DNA时可以采用任何有核细胞。在选择材料时，一般以易获得、再生能力强和对机体损伤最小为前提。根据以上原则，临床上通常以外周血作为提取DNA的材料。下面以从外周血中提取DNA说明DNA提取的原理，从其它组织细胞中提取DNA的原理类似。
2、DNA提取的原理：如果以外周血为DNA提取材料，在外周血中提取DNA就是从有核的白细胞中提取DNA。因此，从外周血中提取DNA包括以下几个关键步骤：第一，破坏红细胞，通常利用红细胞与白细胞膜结构的差异，先使红细胞裂解，经离心后收集白细胞；第二，白细胞裂解：使膜蛋白和核蛋白变性，游离DNA，通常是采用离子型表面活性剂使蛋白质变性；第三，除去变性蛋白质：通常采用蛋白沉淀剂沉淀变性蛋白质，使DNA留在上清液中；第四，在高盐环境下使DNA从有机溶剂如无水乙醇中析出。
（二）RNA提取：
1、提取RNA的材料：RNA是基因转录产生的，由于不同组织在不同时期有特
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定的基因表达，因此，提取RNA的材料取决于所分析基因表达的组织。如要分析肝脏中表达的基因，就需要用肝脏为材料，要分析脑组织中表达的基因，就需要用脑组织为材料。对于在多种组织中表达的基因，应选择较容易获得且对个体损伤最小的材料。
2、RNA提取方法的原理：提取RNA过程中要严格防止RNA酶的污染，所用的试剂和器皿都要经过去RNA酶处理。提取RNA方法很多，目前最常用的是异硫氰酸胍/酚法。该法应用RNA与胍盐形成可溶性复合物的特点，极大地简化了RNA的纯化步骤，获得高质量的RNA。其主要步骤包括：将新鲜或冷冻的组织块切碎称重，迅速加入异硫氰酸胍/酚溶液中匀浆，再加入1/10体积氯仿，剧烈混合，通过离心分离有机相和水相，RNA存在于上清液中，再用异丙醇沉淀RNA。
二、重组DNA技术
重组DNA技术 就是在体外将目的基因与载体连接形成重组DNA分子，再用一定的基因转移方法将重组DNA转入另一细胞或生物体内，以达到扩增和表达目的基因的目的。重组DNA技术是现代分子生物技术发展中的最重要的成就之一。它的产生使人类能根据自己的需要改良生物品种和治疗人类疾病。重组DNA技术涉及多个步骤：第一，需要分离目的DNA；第二，在体外切割或扩增获得目的片段；第三，选择用来携带目的片段的载体DNA；第四，将目的DNA片段与载体连接起来，形成重组DNA分子；第五，将重组DNA分子输入细胞内，使之进行扩增和表达。
（一）限制性内切酶
限制性内切酶的发现是对重组DNA技术的一个主要贡献，可以说没有限制性内切酶的发现，就没有重组DNA技术。限制性内切酶存在于原核生物体内，能识别DNA双链的特定序列并在识别位点或其附近将DNA切断。例如，限制性内切酶Eco RI可以识别6个碱基对的特定序列5’-GAATTC-3’，并在识别序列的G与A之间切割。现已发现的限制性内切酶有数百种，每种限制性内切酶识别并切割特定DNA序列。限制性内切酶的识别序列大多为4-6个碱基对，有些为比较长的序列，限制性内切酶的识别序列通常为回文对称序列，即以对称轴按5’→3’方向阅读时，两条链从5’到3’有相同的序列。如果切割点在对称轴上，所产生的限制性片段（由限制性内切酶切割所产生的DNA片段称为限制性片段）为平
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末端；如果切割点不在对称轴上，所产生的限制性片段为粘性末端，即5’或3’末端突出。
（二）载体
载体是将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。载体具有以下特征：1）分子量小，便于与较大的DNA片段结合，能进入宿主细胞并在其中增殖；2）有多种限制性内切酶切点，各种限制性内切酶切点最好只有单一切点；3）被切割载体DNA插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如抗药基因）以利于在受体中选择性扩增。
细胞内克隆的DNA最初为小分子DNA片段，随着技术的发展，可克隆的DNA片段越来越大。根据克隆片段的大小和克隆目的的不同，载体类型不同。常用的载体有：质粒、λ噬菌体、粘粒、细菌人工染色体和酵母人工染色体等。
（三）重组DNA分子构建
在构建重组DNA分子时，首先是选择目的DNA片段，目的DNA片段可以通过体外扩增获得。为便于目的DNA片段与载体连接，通常在用于扩增目的片段的引物上加上限制性内切酶位点。得到的扩增产物经过限制性内切酶切割，即可产生具有特定末端的片段供与载体连接。
在扩增目的DNA片段的同时，应根据研究目的选择好载体，采用能产生与目的DNA片段末端相匹配的限制性内切酶切割载体DNA。
由于限制性内切酶切割产生的突出末端很短，两个互补末端间的氢键在分子间的连接很弱，并且只能在低温下维持，这需要DNA连接酶（DNA ligase）在两个相关分子间作用才易于形成共价键。平末端也可以连接，只是效果较差，因此，通常选择能产生粘性末端的限制性内切酶。利用相同的限制性内切酶或能产生相同粘性末端的限制性内切酶切割目的DNA和载体DNA，然后通过连接反应，就可以将目的DNA和载体DNA连接起来而形成重组DNA分子。
（四）重组DNA分子扩增和表达
根据所使用的载体确定受体细胞，如使用质粒作为载体通常用大肠杆菌作为受体细胞。首先将重组DNA分子转入受体细胞，利用载体上所携带的选择标记筛选含有目的DNA片段的阳性克隆。然后再对阳性克隆进行扩增，可以得到大量含有目的DNA片段的质粒DNA。
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如果需要获得目的DNA片段的表达产物，应该选择具有表达功能的表达载体。 （五）cDNA及基因组DNA文库
基因文库（gene library）即DNA文库，是用现代 DNA克隆方法人工构建的、含有基因组全部DNA片段的DNA克隆群。成千上万的携有不同DNA片段的DNA克隆中含有基因组的全部基因即基因文库。含有全部基因组DNA的文库称为基因组DNA文库；含有全部cDNA序列的文库称为cDNA文库。
三、核酸分子杂交
核酸分子杂交是指不同来源的两条互补核酸单链，在一定条件下形成双链分子的过程。核酸分子杂交发生在两条DNA单链之间者称为DNA杂交；发生于RNA链和DNA单链之间的称为RNA：DNA杂交。无论是DNA杂交还是DNA/RNA杂交都涉及到两种不同来源的核酸分子：一是用来检测特定核酸的探针，另一是待测核酸分子。
（一）探针：探针是一个DNA或RNA片段，可用某种方法标记，用于杂交检测另外的DNA（RNA）序列。探针可以是单链或双链分子，但杂交时必须是单链形式。
1、 DNA探针：DNA探针可以来自DNA克隆或体外扩增产生，通常是双链。通常在体外采用DNA合成方式进行标记。
2、RNA探针：RNA探针可从DNA克隆中通过体外转录制备。在RNA合成过程中加入标记物就可以使探针进行标记。
3、寡核苷酸探针：用化学合成法制成的短单链DNA片段。一般长15-50个核苷酸。通常采用末端标记方法标记。
（二）常用分子杂交方法
如前所述，核酸分子杂交涉及到用以检测特定核酸的探针和待测核酸，根据待测核酸的存在形式，分子杂交方法很多，常用的有：
1、 原位杂交：原位杂交是指不将待测核酸从细胞或组织中分离出来，而直接在组织切片或细胞标本上进行分子杂交。如用原位杂交法进行基因定位时，就是以待定位的基因为探针，与载玻片上的染色体进行杂交。
2、Southern印迹杂交：能检测通过凝胶电泳分类大小的靶DNA片段，也是最常用的DNA分子杂交方法。此法中，将靶DNA分子用一个或多个限制性内切酶
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