发布时间 : 星期一 文章双向电泳使用说明 - 图文更新完毕开始阅读
件下仍然保持着活性，在这种情况下应当使用蛋白酶抑制剂。每一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用，因此，建议复合使用蛋白酶抑制剂，在商界能得到很多种类的蛋白酶抑制剂。表6提供了常用的抑制剂及抑制的蛋白酶。请参照［12，28，36-40］获得关于蛋白酶抑制的更多方面知识。
表6蛋白酶抑制剂
蛋白酶抑制剂
PMSF
相当常用的抑制剂，使用浓度为1mmol/l。
有效的抑制的酶
PMSF是不可逆抑制剂，能抑制：
■ 丝氨酸水解酶。
■ 一些半胱氨酸水解酶。
使用范围
PMSF在含水溶液中很快失活，在使用前现配。
PMSF在含有巯醇类试剂（DTT或2-去巯基乙醇）时效果不好。这种缺点可以克服，通过将样品在含有PMSF缺少巯基醇类的去污剂溶液中破碎。含巯基类去污剂可以在最后步骤加入。PMSF毒性相当大。
AEBSF具有修饰能力，能潜在改变一种蛋白的PI值。
AEBSF
使用浓度为4mmol/l。
AEBSF在抑制行为上与PMSF相仿,但它更易溶于水并且毒性低。
1mM EDTA,1mM EGTA 这些混合物能抑制金属蛋通常在1mmol/l浓度使用。 白，通过螯合蛋白酶维持
活性所必需的金属离子。 多肽水解蛋白酶抑制剂 这些抑制剂是： ■ 不可逆抑制剂。
■ 在有DTT存在下起活性。
■ 在不同条件下低浓度进行反应。
使用浓度2-20μg/ml。 TLCK,TPCK
(对甲苯磺酰基赖氨酸氯甲基酮,苯磺酰基赖氨酸氯甲基酮)
使用浓度0.1-0.5mmol/l。 Benzamidine
使用浓度1-3mmol/l。
亮抑蛋白酶（Leupeptin）能抑制许多种类的丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶。
抑胃酶（Pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶。
Aprotinin能抑制许多丝氨酸蛋白酶。
苯丁抑制剂（Bestatin）能抑制氨基酸多肽酶。 这两种相近的化合物不可逆地抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶。
多肽蛋白酶抑制剂价格昂贵。 多肽蛋白酶抑制剂是小分子多肽，因此有可能在双向电泳结果中出现，根据其分子大小范围被第二向凝胶分离。
抑胃酶（Pepstatin）在PH为9时不能起抑制作用。
Benzamidine抑制丝氨酸蛋 白酶。
表7 沉淀过程（程序） 沉淀方法 一般程序 硫酸氨沉淀法
在存在高浓度盐时，蛋白质有可能结合起来并从溶液中沉淀出来，许多种潜在的污染物（核酸）将会遗留在溶液中。 TCA沉淀
TCA是一种相当有效的蛋白质沉淀剂。
在含有EDTA的缓冲液中（>50mM）处理蛋白质，最终蛋白浓度大于1mg/ml。慢慢地将硫酸铵加入，至饱和液中并且搅拌10-30分钟，利用离心将蛋白质分离。
在浓缩液中加入TCA，使之最终浓度为10-20%，并且在冰浴中沉淀30分钟。也可以将组织直接在10-20%的TCA中粉碎，这种方法可以限制蛋白质水解和其他蛋白修饰作用，离心并用丙酮或乙醇洗去残留的TCA。
在浓缩液中加入3倍体积的预冷丙酮，使蛋白质在-20℃条件下沉淀2小时。用离心法收集蛋白质，通过空气干燥法或冷冻干燥除去残留的丙酮。
将破碎或破解完的样品悬在含有20mmol/lDTT或0.07%巯基乙醇的10%TCA溶液中。在-20℃条件下沉淀蛋白质45分钟，用离心方法收集蛋白，并且用含有0.07%巯基乙醇或20mmol/lDTT的预冷丙酮溶液清洗。通过空气干燥法或冷冻干燥除去残留的丙酮。
样品中的蛋白能被抽提进入水或缓冲液饱和酚溶液中，在酚阶段利用含有0.1mol/l的乙酸胺的甲醇溶液沉淀蛋白质，用含有乙酸氨的甲醇溶液清洗沉淀几次，然后用丙酮清洗，将残留的丙酮蒸发掉。
使用范围
许多的蛋白质仍然留在高盐浓度的溶液中，若想得到所有蛋白质，这种方法不可取。然而它可以用来进行预分离和蛋白质富集。残留的硫酸铵能影响等电聚焦，因此，必须除去有关盐离子，参照2，4节的方法。 蛋白质可能很难再溶或完全不能再溶。用丙酮或乙醇将残留的TCA充分洗净。
长时间地将样品暴露于这种低pH值溶液中，能引起蛋白质降解和修饰。
丙酮沉淀法
这种有机溶剂常用来沉淀蛋白质。许多有机溶剂污染物（去污剂，酯类）残留在溶液中。 丙酮、TCA沉淀蛋白 在双向电泳样品预处理过程中 ，往往用TCA和丙酮的混合物来沉淀蛋白，这种方法比单独使用TCA或丙酮效果好。
蛋白质可能很难重新溶解或完全不能重溶。
长时间地将样品处于这种低pH值的溶液中能使一些蛋白变性或修饰。
乙酸胺、甲醇溶液沉淀蛋白质并且用酚抽提
这种方法在处理含有高水平的干扰物质的植物样品中被证明是有用的。
这种方法很复杂并很费时。
2.3 蛋白质沉淀过程
进行双向电泳过程中，蛋白质沉淀是任选的步骤。蛋白质沉淀被用来从污染杂质（如盐，去污剂，核酸，酯等）中有选择性地分离蛋白质，这些污染杂质否则能影响双向电泳的结果，此后再将沉淀物溶在样品液中。这种方法也能从稀浓度来源液（植物组织，尿）中浓缩样品。没有一种沉淀方法是十全十美的，有时一些蛋白质沉淀后不能在随后的样品再溶中溶解。因此，在样品预处理中使用沉淀方法有可能改变样品蛋白的成分。如果双向电泳想要完全和精确地得到样品中的蛋白质，避免使用沉淀和复溶的方法。表7列出了一些可用的沉淀方法。若在样品处理中要使用蛋白质沉淀方法，一般只用一种沉淀方法。参考［14，15。41］来获得更多的蛋白沉淀方法。
2.4 除去影响双向电泳结果的污染物
在样品中的非蛋白杂质能够影响蛋白质分离和随后的双向电泳结果的显影。
因此，样品预处理时可包含几步来除去这些杂质。表8列出了影响双向电泳结果的物质以及除去的方法。参考资料［12］给出了对去除干扰物质的进一步探讨。
表8 影响双向电泳的污染物 污染物 除杂原因 残留在缓冲液中的盐，和其它带电小分子。这些物质是由样品预处理过程中残留下来的。
盐能使电泳混乱，因此必须除去，或尽可能地使其保持较低浓度。
IPG胶条中的盐能增加胶条的导电率。在离子移到胶条的两端前，蛋白质聚焦将不能发生，这样延长了等电聚焦所需时间，也能引起水的流动，从而使胶条的一端保持肿胀状态而另一端则干燥的状态。在胶条中的盐能引起胶条两端很大一块区域内蛋白没有聚焦。若要将样品在IPG胶条重水化时加样，重水化液中的盐浓度应当低于10mmol/l。 若样品在样品杯中加样，在样品中高达50mmol/l的盐浓度是可以容忍的，然而，由于蛋白质迅速向低盐浓度的区域移动，在样品加样点蛋白质有可能发生沉淀。
在任何样品溶解液中都存在着内部带电小分子。这些物质往往带有负电荷，在阳极端能引起蛋白聚焦不完全。 离子去污剂（通常SDS）常常在蛋白质提取和溶解过程中使用，但是对等电聚焦的影响特别大，除非SDS除去或将SDS分离。SDS能与蛋白质复合，并产生带负电荷的复合物，不能正常的聚焦。
除杂技术
可以通过下列方法除盐： ■ 滤膜渗析 ■ 旋转膜渗析 ■ 凝胶过滤 ■ 沉淀/重溶法
滤膜渗析法是相当有效的除盐方法，样品的损失量小。然而，这过程需要大量时间并且需要样品体积较大。旋转膜渗析法速度较快，但存在着渗透膜吸附蛋白的问题。旋转膜渗析法可以在加尿素和去污剂前进行。
凝胶过滤是可取的，但往往产生蛋白丢失。
沉淀/重溶法是除去盐和其它污染物相当有效的方法，但它能产生蛋白丢失。
内部的带电小分子
丙酮/TCA沉淀法对除去这些物质相当有效，也可以利用其它去盐技术。
在含有两性电解质或非离子去污剂（CHAPS、Tritonx-100、或NP-40）的重水化液中稀释含有SDS的样品直至最终SDS浓度为0.25%或更低，并且使其它的去污剂和SDS的比例为8：1［24］。 丙酮沉淀能部分除去SDS。
在室温下沉淀能除去大部分的SDS但蛋白沉淀在-20℃更彻底。 富含核酸的样品用不含蛋白酶的DNase/Rnase混合物使核酸降解成单个核苷酸或寡核苷酸。在样品中加入0.1倍体积的含1mg/ml DnaseA，0.25mg/ml RnaseA和50 mmol/l的MgCl2溶液，并进行冰浴。 注意：DNase和RNase蛋白有 可
离子去污剂
核酸（DNA，RNA）
核酸能增加样品的粘度，并且
能产生背景污染。高分子量的核酸能堵塞凝胶孔隙。核酸能与蛋白质通过静电反应的结合，阻碍聚焦。若将分离的样品用银染，核酸也能被染色，这样在第二向胶产生背景污染。