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湖北大学生命科学学院
微生物学设计性实验
枯草芽孢杆菌的紫外线诱变实验
吴碧舟、徐小清、杨勇
2015/11/20
【紫外线对微生物有诱变作用，主要是引起DNA的分子结构发生改变，同链的DNA相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌体遗传性变异，表现出的形状同野生型菌株有一定的差异。紫外线的微生物诱变育种，用以改变它的遗传性和改变微生物的特性，使微生物符合人类的需要。】
枯草芽孢杆菌的紫外线诱变实验
一、实验目的
1.学习紫外线灭菌的操作方法，了解紫外线对微生物灭菌和诱变育种的双重生物学效应；
2.紫外线的照射时间和致死率的关系；
3.观察紫外线对于枯草芽孢杆菌的诱变效应；
4.巩固显微直接计数、稀释平板涂布等微生物实验技能；
二、实验原理
紫外线生物效应的一个典型应用是微生物诱变育种。微生物的遗传性也不是不可改变的，改变微生物的遗传性可用物理方法和化学方法。紫外线对微生物有诱变作用，主要是引起DNA的分子结构发生改变，同链的DNA相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌体遗传性变异，表现出的形状同野生型菌株有一定的差异。紫外线的微生物诱变育种，用以改变它的遗传性和改变微生物的特性，使微生物符合人类的需要。用紫外线照射微生物，使它产生诱变——新品种的微生物，用这种方法诱变育种速度快，可以在短期内使微生物的特性得到大幅度的变异，以符合我们人类的需要。微生物诱变育种在抗菌素，维生素等生产上应用很广泛。它在微生物冶金，微生物污水处理等方面也有许多实际意义。
在枯草芽孢杆菌的紫外线诱变实验中，我们采用的是菌株分泌胞外酶的作用效果，来作为观察枯草芽孢杆菌在紫外线下是否发生了基因突变。
三、实验材料及器械 菌种：枯草芽孢杆菌
仪器:血球计数板、显微镜、紫外线灯、离心机、电磁搅拌器、培养皿、三角瓶、镊子、高压蒸汽灭菌锅、游标卡尺（直尺） 试剂：淀粉琼脂固体培养基、无菌水
四、实验步骤 制备菌悬液
1.取培养24～28h的枯草芽孢杆菌的斜面4～5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并装入三角瓶中振荡20～30min，以打碎菌块（或者在实验前一天接种一瓶100MLLB液体培养基枯草芽孢杆菌，在200r/min、37℃条件下振荡培养）；
2.将上述菌液离心，3000r/min，离心15min左右，弃上清液，加无菌生理盐水，制成菌悬液；
3.用显微镜直接计数法计数，调整菌悬液的浓度为10?8个/mL;
倒平板
待已经灭菌的淀粉琼脂平板冷却至50℃左右时倒平板，平均数量为30个，凝固后待用；
紫外线处理
1.将紫外线灯开关打开预热约20min;
2.取用两个无菌平皿，分别加入上述菌液5mL,并将无菌搅拌棒放入平皿中； 3.将盛有菌悬液的2个平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15w的紫外灯下分别搅拌照射1min和3min；
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4.在红光或者用纸包裹的白光下，将上述经过诱变的菌悬液以10倍稀释成10?-1～10?-6； 涂平板
取10?-4、10?-5、10?-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂3支，每支100微升。以同样的操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板做对照。 培养
用黑布将平板包好，不要见光，置于37℃恒温培养箱倒置培养24h~28h，注意做好标记。 计数
取出平板进行计数，计算出每毫升菌液中的活菌数（对照平板），同样计算出紫外线处理1min以及3min的存活细胞数和致死率。 观察诱变效果
将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈在平板内加入碘液数滴，在菌落周围会出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值），然后同对照平板相比较。根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。这样可以得到诱变效果好的枯草芽孢杆菌菌种。 绘制图表，形成实验报告。
五、实验结果
表一：紫外线处理1min以及3min以及对照组的存活细胞数、存活率、致死率 稀释倍数 平均菌落 -4-5-610 10 10 存活率% 致死率% 处理时间 （数/皿） 诱变剂 （min） 紫外线处理 （UV） 表二：诱变效果比较
0（对照） 1 3 结果 处理 UV处理
透明圈和菌落直径大小（㎜）及其HC比值 1 2 3 4 5 6 透菌 H透菌 H透菌 H透菌 H透菌 H透菌 H明 C明 C明 C明 C明 C明 C圈 落 比圈 落 比圈 落 比圈 落 比圈 落 比圈 落 比值 值 值 值 值 值 1min 3min 3
对照
注：由于紫外线诱变存在随机性，实验结果存在一定不可预测性。又紫外线照射时间过长，枯草芽孢杆菌的存活率会很低，在平板上生长情况不一，在表二中只记录6个平板的数据，实际上每一种处理条件下都有9个平板，菌落数在5-6个左右的平板数量不知道。
六、注意事项
1.用显微镜直接计数法计数，调整菌悬液的浓度为10?8个/mL。用血球计数板显微直
接计数所得到的的结果只是大概，在调整菌悬液的浓度时，要注意灵活稀释。 2.在离心、稀释、涂布等操作要保证无菌操作，避免杂菌对实验结果产生影响； 3.紫外线处理时要严格控制时间。可能在1或3min，枯草芽孢杆菌的致死率就达到100%，因此在实验前可以做预实验，尽量使得紫外线处理的致死率不要太高。
4.在用游标卡尺或者直尺量透明圈和菌落的直径大小时，对于形状不规则的，要采取减小误差的统一测量标准。
七、实验思考
1、经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？
2、紫外线灭菌和紫外线诱变育种作用机理的差异
3、结合枯草芽孢杆菌的紫外线诱变实验过程和结果，谈谈诱变育种的特点
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