分子实验报告 - 图文

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将有机玻璃内槽放入电泳槽中,加入0.5×TBE电泳缓冲液,以盖过胶板为宜。

胶板内的样品小槽

质粒DNA的酶解:

1) 新提的质粒,在20uL的体系中用单一酶NotⅠ进行处理,即:

质粒DNA 8μL 10×H Buffer 2μL NotⅠ 1μL 无菌水 5μL 0.1% BSA 2ul 0.1% Tritonx-100 2ul

注意:以上物质的加入顺序:无菌水——质粒——Tritonx——BSA——H Buffer——NotⅠ,酶一定要最后再加!试剂的加入量甚微,所以要确保试剂加入到了体系中。

2) 37℃,保温3-4小时。 3.加样

用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内,每次加完一个样品为了避免交叉污染,各样品用不同的吸头,以免造成限制酶被污染。加样时,吸头不要插入胶板内,防止碰坏样品槽周围的凝胶面,每个样品槽的加样量不宜过多,本实验加样量为:18ul样品+2ul Loading Buffer 。(每块胶板需点一个Marker,这里即为λDNA/ Hind Ⅲ)

加样要注意加样器不要戳胶,尽量不要有气泡,如果有气泡可以用加样器轻轻的吸出。 4.电泳

加完样品后应立即通电,进行恒压电泳。在低压条件下,线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系,为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率,电场强度不应高于5V/cm。此实验中用到的电压为80V,电流26mA.

当溴酚蓝染料(蓝色)移动到距离胶板下沿约1~2cm处,停止电泳。 5.染色

将电泳后的凝胶浸入EB染液中,进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA带。染色20min后,用大量水冲洗。注意要带手套,防止EB污染和毒害作用,凝胶放入染液中时动作要轻,不要把胶弄破,

也不要让染液溅出。 6.观察

在波长为254nm的紫外灯下,观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处显示出红色荧光条带。 用凝胶自动成像仪处理代替。 7. 成像结果:

1 2 3 M 5 6 7 8 9 10 11

NotⅠ酶切结果

1.姚雨竹 2.王远馨 3.甘广丽 4.Marker 5.李墨 6.贺选 7.胡慧 8.徐鸿琛 9.严安(10μl) 10曾雪 (10μl) 11.对照

由上图可以看到,对应于marker和质粒对照的图谱,在第四条带处有很明显的条带出现,说明环状的质粒DNA被切成线性的DNA链。 五、注意事项

1.基因工程是微量操作技术,DNA样品与限制性内切酶的用量都极少,必须严格注意吸样量的正确性,确认样品确实被加入反应体系。

2.酶应在-20℃冰箱中保存,取酶的操作必须严格在冰浴条件下进行,用完后立即放回-20℃冰箱,不要将酶在冰浴中放置过久,或放在高于0℃以上的环境中,以防止酶失活。

3.酶切加样次序为水、缓冲液和DNA,然后混匀。酶永远是最后加入的,如将酶直接加入浓缩的缓冲液中会引起严重的失水。酶切反应体系的溶液加完后,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底,不要用振荡器。此步操作是整个实验成败的关键,注意防止错加、漏加。 4.为了避免交叉污染,各样品用不同的吸头,且每次取酶时务必换吸头,以免造成限制酶被污染。 5.溴化乙锭是一种强烈的诱变剂,有毒性,使用含有这种染料的溶液时,应戴手套进行操作。勿将溶液

滴洒在台面或地面上,用后用水彻底冲洗干净。 六、思考题

1.简述EB显色的原理。

答:EB含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团,它与DNA结合几乎没有碱基序列特异性,在高离子强度的饱和溶液中,大约每2.5个碱基插入一个EB分子,当染料分子插入后,其平面基团与DNA螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用,该基团的固定位置以及与碱基的密切接近,导致与DNA结合的染料呈现荧光,并且荧光产率比游离的染料有所增加。 2.使用溴化乙锭时应注意什么?

答:溴化乙锭具有高致癌性,使用时不能沾在手上或身体上,也不能溅在实验台上,要小心使用,带戴上手套。

3.说明不同电压对电泳结果的影响是什么

答:电压越大,跑胶越快,条带之间就难于分辨;电压越小,跑胶越慢,条带分开的距离就越大越清晰。 4.如何判断DNA的纯度?

答:测定260nm处的吸光值,并与280nm处的吸光值进行比较,根据比值大小判断纯度。

实验三 感受态细胞的制备及转化

一、实验原理

感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态,只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。转化是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。转化的基本原理是细胞处于0℃,CaCl2低渗溶液中,细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸混合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA复合物,在选择性培养基平板上培养,可选出所需的转化子。

二、实验目的

1.学习和理解影响细胞感受态的因素,掌握感受态细胞的制备方法。

2.掌握质粒的转化方法。把体外DNA引入受体细胞,使受体菌具有新遗传性,并从中选择出转化子。 三、实验材料和用具

材料:自制的质粒DNA、大肠杆菌(E.coli)菌种(DH5α菌株)。 试剂:

LB琼脂平板 (无抗生素)、

LB琼脂平板 (含50μg/L氨苄青霉素)、 LB液体培养基5mL(无抗生素)、 LB液体培养基100mL(无抗生素)、

LB液体培养基5mL(含50μg/L氨苄青霉素)、

0.1mol/LCaCl2溶液(灭菌备用)。 仪器:

恒温培养箱、恒温摇床、接种环、涂布器、冷冻离心机、离心管、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅。

四、操作步骤

(一)大肠杆菌感受态细胞的制备

1.从新活化的E.coliDH5α菌平板上挑取一单菌落,接种于5mL液体培养基中,37℃振荡培养过夜,

直至对数生长期。将该菌悬液以1:50接种于50mL LB液体培养基中,37℃快速振荡培养3~4h。 2.取1.4ml上述培养的菌液放入离心管中,在冰上放置10min,于4℃5000r/min离心10min,再取1.4ml菌液,冰上放置10min后在相同的条件下离心10min。

3.可用加样器将残余液体尽量去净,用1mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置15~

30min。(用加样器反复小心的吹打,使细胞悬浮) 4.于4℃,5000rpm离心10min。

5.弃上清,加入200μL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液,小心悬浮细胞,冰上放置片刻,即制成了感受

态细胞悬液。

6.制好的感受态细胞可在冰上放置,24h内直接用于转化实验,也可加入占总体积95%左右高压灭菌

过的甘油,混匀后分装于Ep管中,-70℃条件下可保存半年至一年。

(二)平板培养基制备(倒平板)

将配制好的120ml每瓶的两瓶培养基放到微波炉中加热融化(此过程中要时时摇动培养基,避免冲塞和融化不匀),待培养基冷却到50℃左右时,取出其中一瓶加入120ul的卡那霉素,摇匀后从下往上分装到8个培养皿中,分装要尽量均匀,培养基以浸没皿地的量为准,倒完后轻轻晃动培养皿,使培养基分散均匀;另一瓶不加抗生素,直接分装到8个培养皿中,做好标记后用保鲜膜包好,整个过程在超净工作台内完成。

(三)细胞转化

取200μL摇匀后的感受态细胞悬液,进行下一步的转化,转化如下(单位:μL):

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