发布时间 : 星期日 文章牛奶和乳制品中唾液酸的测定 - 图文更新完毕开始阅读
称取大约100-500μg唾液酸的样本，放入200ml的烧瓶中。随后加入100ml的热水（60?C），并在室温下搅拌悬浮液10分钟，冷却至室温后，加水至刻度处。在微管中用200μl的样品溶液与相同体积的甲酸（1M）混合，在80C下水解2h。溶解后的样品溶液放置冰上冷却，再转移至离心管（Ultrafree MC Biomax-30, Millipore），在5000g下离心10min。在棕色的微管中，将200μl的离心后的水解产物和相同体积的DMB溶液混合，在80C下加热50min。衍生后的样品随后在冰上冷却，再加入400μl水使之稀释。 <3>色谱：
DMB衍生物的分析是由Class-VP软件的控制的Shimadzu Prominence HPLC系统和Shimadzu RF-10Axl荧光探测器（Shimadzu,Kyoto, Japan）的联用装置完成的。荧光在×4增益，中等灵敏度，1.5s回应时间，5Hz进样率的条件下由发射器控制，分别在448nm和337nm波长下进行激发。唾液酸的分离是在30?C下由Agilent Technologies（Santa Clara, CA, USA）提供的Zorbax SB-Aq（安捷伦SB-Aq）快速解析柱（3.5 μm, 4.6×50 mm）中完成的。与水/乙醇/乙酸(75:25:0.05, v/v/v)混合液稀释的唾液酸DMB衍生物以2.0ml/min的速度进行流动。2.5min后，柱子用水/乙醇/乙酸（80:20:0.05, v/v/v）洗脱1.2分钟，再在开始的条件下重新平衡3.3min（共7min）。每天结束后，柱子要在含水乙醇（1:1，v/v）以1.0ml/min的流动速度下进行1h的清洗。通常，在更换前可以使用2000次，每次可以加10μl体积的样。自动采样器要在4?C下保存。衍生后的Neu5Gc 和Neu5Ac分别在保留时间为1.3min和1.6min下进行洗提。Neu5Gc 和 Neu5Ac一系列标准浓度溶液与样品的处理方式相同（除在水解时未加热外），在这种条件下，再进行校正。峰值区域通常可用来进行量化。 <4>可靠性检测：
我们选择七种产品作为母体对这种方法进行可靠性的检测。所有的样品都以牛奶为基础，包括浓缩乳清蛋白，奶粉，成长奶粉，粉状冲剂饮料，液体冲剂饮料，儿童麦片和酸奶。另外，以大豆为主的婴儿配方产品在同位素示踪实验中用作空白对照。
为对唾液酸的线性范围进行更全面的研究，我们对五种不同浓度范围的样品进
行分析。对每种浓度范围，分别对8个均等间隔的浓度进行进样，每份样进三份。在色谱柱中，对Neu5Ac浓度的研究分别在0.02 -0.16 ng, 0.13- 0.29 ng, 0.22-1.01 ng, 0.61 - 4.89 ng, 和4.48-5.63 ng之间，对Neu5Gc的浓度研究则在0.004-0.031 ng, 0.02-0.18 ng, 0.11 -0.89 ng, 0.57-4.56 ng, 和 4.18-5.24 ng之间。线性的程度是由校准曲线图，响应因素和残样量共同决定的。
检测下限（LoD）是由每种被分析物在保留时间中测量到的基线噪声和三倍基线噪声高度时的被分析物浓度共同决定的。Neu5Ac在色谱柱中的检测下限为15.6pg。Neu5Gc在色谱柱中的检测下限为5.4pg。
为了对重复性和再现性进行测定，每个样本由三位不同的分析师在至少不连续的8天内对同一样本在同一实验室里通过6种不同的DMB试剂进行处理，4种不同批次的标准唾液酸溶液和3种不同的分析色谱柱进行分析。
我们对该方法的准确性检测是将每个被分析物的母体进行8种不同示踪同位素的标记，分别再对它们三种不同水平的浓度进行检测（示踪同位素的水平需要适应每种样本的母体且各值要处于线性范围内）。每种样本母体在重复的条件下对其各示踪同位素水平进行6次分析。
所有数据的分析是在充分有力的统计数据和内部统计程序Q-stat下进行的。 ②实验方案的选择： <1>色谱条件：
DMB标记的唾液酸一般是在混合物乙腈，乙醇和水做流动相的条件下在反相色谱柱中进行分离的。有时，酸或缓冲液对唾液酸的修饰会对唾液酸的分离进行调节。Table2中可以找到对几种流动相的总结。目前对分离条件的研究是基于Hara和他的同事的成果，即使用DMB对唾液酸（Neu5Gc和Neu5Ac）进行衍生。 Hara和他的同事共列出十一种利用乙腈/乙醇/水（9:7:84, v/v/v）做流动相的色谱柱（table3）。包括4种长度为150mm的色谱柱（颗粒大小3 - 5 μm，柱径2.1 - 4.6 mm），6种用于快速HPLC的色谱柱（4.6×50 mm)，颗粒大小为1.8 -3.5 μm和一种颗粒大小为3.5-μm的与苯基结合的固定相的色谱柱（4.6×50 mm)。在长的色谱柱中，Zorbax SB-C18与其他色谱柱相比分离效果最好，且峰形最好（拖尾因子：Neu5Gc：1.08，Neu5Ac ：1.04）。Sunfire C18与它相似，但拖尾
因子较高。在短的色谱柱中，Zorbax SB-C18和 Sunfire C18效果也是最好的。Sunfire C18对唾液酸的分析和高分辨率的测定能与理论值有很好的符合性。尽管Neu5Gc在 Zorbax SB-C18色谱柱中的拖尾因子稍低，但被分析物这两种色谱柱中的拖尾因子基本相似。综上，最优化的方案为选择Zorbax SB-C18做色谱柱。
Table3：对Neu5Gc和Neu5Ac的不同HPLC色谱柱的比较
我们对几种混合溶液在不同比例的乙腈，乙醇和水（也可用含水的缓冲液或稀酸代替）的混合物做流动相的条件下在Zorbax SB-C18中进行了检测。在使色谱柱适应流动相的前提下，虽然可以将两峰间的分辨率由1.61提高到2.87，但却同时会影响到峰的对称性。不过，随着流动相不断地优化，最近出现了一种新的，快速的色谱柱Zorbax SB-Aq。因为它有优良的对称性，且要比Sb类型的色谱柱有更优良的性质。同时，在所有的流动相下，SB-Aq均比SB有更好的峰形，尽管分辨率有所下降。因此最终选择以乙腈/乙醇/乙酸（25:75:0.05, v/v/v）为流动相，以Zorbax SB-Aq(4.6 * 50 mm, 3.5 μm)为色谱柱的色谱系统。它的选择是基于层析效能，配制流动相的难易度和与液相色谱-质谱联用的综合考虑下做出的。标准物和样本的色谱峰图见Fig.1. <2>水解条件的最优化：
我们可以用酶或酸对唾液酸的复合物进行水解，从而使其从结合糖中释放。尽管酸水解便宜有效，但却很难在被分析物的释放和水解过程中达到很好的平衡。比如，有报道称在50 mM 硫酸或 100 mM 盐酸(50 min, 80 C)的水解下，唾液酸会有10%的损失。相似的，在25 mM盐酸, 25 mM 三氟乙酸(TFA), 或2 M乙酸 (2 h,80 C)的水解下，会造成唾液酸20%的损失。根据Lamari，Karamanos 和
Fig.1：Neu5Gc和Neu5Ac在不同样品中的色谱图。G：Neu5Gc，A:Neu5Ac
Schauer的研究，甲酸造成的损失最小，但可能不能彻底完成水解。为了让唾液酸更有效地被释放和最大限度的减小损失，因此就有很多唾液酸在不同水解条件下的报道（table2）。虽然酶水解在充分的反应后也不大可能降解唾液酸，但是因为在酶的水解后仍有很多未被水解的残余物，因此很难达到唾液酸的定量测定。所以，就有很多酸水解和酶水解的水解条件方案，对唾液酸的结合物进行水解。