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药物分析：姓名：朱文鹏 学号：08301010021
文章出自：
Véronique Spichtig, Julien Michaud, Sean Austin，Determination of sialic acids in milks and milk-based products，Analytical Biochemistry 405 (2010) 28–40
牛奶和乳制品中唾液酸的测定
作者：Véronique Spichtig, Julien Michaud, Sean Austin
摘要：唾液酸被认为是婴儿牛奶，儿童牛奶和乳制品中的重要成分之一。因此，许多公司都将唾液酸列为其产品成分。为核实其真实性，需要合适的方法进行分析。这项研究的目的就是通过HPLC（高相液相色谱）建立既快速又灵敏的方法来检测N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)这两种普遍存在的唾液酸。唾液酸在甲酸弱酸性质的水解下从寡糖链，糖蛋白和糖脂中释放出来。然后在1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧苯（DMB）的作用下，发生衍生反应，随后2分钟内可在Zorbax SB-Aq（安捷伦SB-Aq）快速解析柱中分离。这项方法在多种以牛奶为主的含0.3mg/100g到900mg/100g水平唾液酸的产品和食品中证实有效。同位素示踪实验显示唾液酸的回收率可以达到87%-108%。除一些特例外，其扩大的测量不确定度对Neu5Gc来说一般低于15%，而Neu5Ac或唾液酸的总量则一般低于10%。同时这种方法快速，准确，并且很容易在常规实验室建立依存性分析。 研究背景 ： ①唾液酸的简介：
唾液酸家族是一类基于神经氨酸结构的碳水化合物，最近将KDN及其衍生物也算作唾液酸家族的一员。到目前为止，已有50种唾液酸被鉴定出来。唾液酸可以在脊椎动物，一些无脊椎动物和一些微生物中被检测到，但好像并不存在于植物和原核生物中。已经有很多实验对唾液酸的生物学功能进行了解释。研究表明，唾液酸可能参与了分子间和细胞间的反应，细胞分化，增殖和癌的发生。它们也可能是细菌和病毒感染致病的重要因素。最近的研究甚至发现唾液酸在学习和记忆中扮演了重要的角色。唾液酸是牛奶的成分之一，作为牛奶中的寡糖成分，可在大脑的发育和保护机制的形成中扮演了重要的角色。
②奶制品中唾液酸的情况：
我们已经研究了人奶，牛奶和婴儿配方奶粉中唾液酸的水平（table1）。在人初
Table1：人奶，牛奶和配方奶粉中唾液酸的水平
乳中，唾液酸可以达到2000mg/L，但大约十周后就会降至200-300mg/L。牛初乳（600mg/L）也比成熟牛奶（200mg/L）中唾液酸的水平高，但低于人乳中唾液酸的含量，一些研究证实成熟的牛奶中唾液酸的含量可能会低至10-65mg/L。在不同的牛奶中唾液酸水平的差异非常大。这主要是因为牛的种类，产地或供给的营养等造成的，也有可能是这些因素的综合。现在，对它们的系统研究还没有报道。另外，人奶中唾液酸的主要存在形式是糖蛋白，而牛奶中的主要形式是寡糖。 ③对奶制品中唾液酸的分析：
我们已经研究了人奶，牛奶和婴儿配方奶粉中唾液酸的水平（table1）。在人初乳中，唾液酸可以达到2000mg/L，但大约十周后就会降至200-300mg/L。牛初乳（600mg/L）也比成熟牛奶（200mg/L）中唾液酸的水平高，但低于人乳中唾液酸的含量，一些研究证实成熟的牛奶中唾液酸的含量可能会低至10-65mg/L。在不同的牛奶中唾液酸水平的差异非常大。这主要是因为牛的种类，产地或供给的营养等造成的，也有可能是这些因素的综合。现在，对它们的系统研究还没有报道。另外，人奶中唾液酸的主要存在形式是糖蛋白，而牛奶中的主要形式是寡糖。 我们已经有很多分析唾液酸的方法，主要可以分为以下两种：分离法（色谱分析，电泳），不分离法（光谱技术）。一些光谱法的优点在于不需要将唾液酸从结合糖
中释放出来，而是将其作为一个整体进行分析，其中使用到的主要试剂有??-二甲氨基苯甲醛-HCL，苔黑酚，间苯二酚/Fe3+，Cu2+/HCL和高碘酸-3-甲基-2-苯并噻唑腙盐酸盐。其他流行的光谱技术，比如：硫代巴比妥酸分析，商业用途的酶联分析，都需要在分析前，将唾液酸从结合糖中分离出来。光谱法的优点在于它们能直接的进行应用，并且所用的仪器并不昂贵。可是有很多成分都会干扰对唾液酸的分析，这是限制它应用于一些复杂的物质的原因。 ④唾液酸分析前的处理
所有基于对唾液酸进行分离的方法，都需要在分析前将唾液酸从结合物中释放出来。我们有两种释放出游离唾液酸的方法：酶水解，酸水解。酶的水解通常需要在温和的条件下进行，这样唾液酸就能以稳定的形式存在，并且不会被修饰。而酶解法的缺点则是不能将其应用于不同类型的唾液酸，同时因为唾液酸结合的分子类型不同，不能使唾液酸100%的从结合物中释放。酸水解的环境较为强烈，唾液酸有可能会在分析前降解或修饰，但唾液酸的释放基本是100%的完成。因此，对唾液酸水解的研究就是在它的释放和降解或修饰中寻找平衡。于是就有很多不同的水解方法（table2）。
在释放出游离的唾液酸后，有很多的方法可以进行分离，包括薄层色谱法，液相色谱法，气相色谱法，毛细管电泳法和质谱法，同时也可对这些技术联用进而进行更有效地分离。大部分唾液酸在分析前需要进行衍生反应。在使用液相色谱法时，我们首先要能在紫外线（UV）和荧光下对分子进行灵敏的检测。在气相色谱法中，被分析物应易于挥发。这些都需要对被分析物进行衍生化反应。高效阴离子交换色谱联用脉冲安培探测法（HPAEC-PAD）是少数的一种对唾液酸不需要进行衍生化即可进行灵敏分析的方法。很可能目前对唾液酸分析的最流行方法是Hara和他的同事在1987年时提出的，他们使用1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧苯（DMB）对唾液酸进行衍生作用，然后使用反向高效液相色谱进行分离分析。它的优点在于DMB衍生物对α-酮酸的特异性和使用荧光进行检测上，这能让分析有很好的选择性和灵敏度。 ⑤小结：
唾液酸作为婴儿和儿童奶制品中的重要成分越来越受到重视。因此，很多公司
都将其列为产品的配方之一。为了帮助产品的发展，并且能对唾液酸标识值进行有效的核实，就需要有合适的方法进行分析。为在最短时间内，使唾液酸的回收值最大，就需要对样品进行充分的水解和衍生。另外，进行反相分离的方法也被一种快速色谱柱所替代，这样，N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)在两分钟内即可被分离和洗提。 研究内容及实验方案： ①实验的材料和方法： <1>试剂：
所有使用的试剂都应达到分析纯或分析纯以上的标准。甲酸，硫酸，乙酸，甲醇（HPLC级纯）从Merck（Darmstadt, Germany）购买，硫酸氢钠，DMB，2-巯基乙醇，十二烷基硫酸钠从Fluka（Buchs, Switzerland）购买。两种经过认证的唾液酸Neu5Ac (≥98%) 和Neu5Gc (≥95%)购买于 Sigma（St. Louis, MO, USA）和U.S. Pharmacopeia（USP, Rockville,MD, USA）。水是从Milli-Q Plus water purification system（Millipore, Bedford,MA, USA）获得。神经氨酸酶（a-2→3,6,8,9）[Arthrobacter ureafaciens（蛋白组级）]购买于Sigma。唾液酸酶-A（在A. ureafaciens重组，在Escherichia coli中表达）从Prozyme（San Leandro, CA, USA）获得。DMB (7.0 mM)保存于含2-巯基乙醇(0.75 M)和十二烷基硫酸钠(18 mM)的醋酸(1.4 M) 中。 <2>步骤：
Table2：唾液酸分析前处理的方法