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ACGGCA？为什么？
答：GATATC 和AAATTT，因为它们是回文序列。 7．用Klenow 酶填补的办法可使5' 黏性末端转变成平末端。这种方法常使DNA 上的某些限制酶的识
别位点消失。请问，对于下列限制酶，用这种方法处理会不会使它们的识别序列都消失？
BamH I (G
↓GATCC)、Taq I (T↓CGA)、BssH II (G↓CGCGC)。 答：BssH II 不会。
8．当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施? 为什么?
答：注意星号活性；先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶
失活，再加第二种酶，否则，易产生星号活性，或使用通用缓冲液。 9．什么是同裂酶？什么是同尾酶？ 10．何谓限制性物理图谱？
答：限制性物理图谱即限制性内切核酸酶作图(restriction mapping)。简单地说就是DNA 分子中限
制性内切核酸酶切割位点的定位，即DNA 分子中各种不同限制性内切核酸酶的酶切位点的线性排列 图。标明限制酶在DNA 分子上的限制性位点的数目、限制性片段大小及其线性排列的顺序。
（二）问答
1．什么是细菌的限制—修饰系统 (Restriction ModificationSystem，R-M system)? 答：细菌中有作用于同一DNA 的两种酶，即分解DNA 的限制酶和改变DNA 碱基结构使其免遭
限制酶分解的修饰酶。而且，这两种酶作用于同一DNA 的相同部位，把这两种酶所组成的系统称为限 制与修饰系统。
2．细菌的限制—修饰系统有什么意义? 答：不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统。修饰的
本质是通过甲基化酶将DNA 中某些碱基进行甲基化修饰，由于宿主自身DNA 上的这些位点进行了修
饰，限制酶就不能进行切割。而外来的DNA 在相应的碱基上没有被甲基化，宿主的限制酶通过对该位
点的识别来分辨敌我，并将入侵的外来DNA 分子降解掉。所以DNA 限制作用和修饰作用为细胞提供 了保护。
3．说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 答：基本原则：属名+种名+株名十序号。
①首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写。 第二个字母：取种名的第一个字母，斜体小写。
第三个字母：取种名的第二个字母，斜体小写。
第四个字母：若有株名，株名则作为第四个字母，用正体。
②顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、II、III 等，用正体。 ③所有的限制酶，前面还应带有系统的名称,如限制性核酸内切酶 R. Hind III。修饰酶则在前面加上
甲基转移酶M，如甲基转移酶M. Hind III。在上下文已清楚只涉及限制酶的地方，R 可被省去。
4．何谓限制性内切核酸酶的切割频率?
答：切割频率是指限制性内切核酸酶在某DNA 分子中预测的切点数。由于DNA 是由四种类型的
单核苷酸组成，假定DNA 的碱基组成是均一的，而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分布的，那么
对于任何一种限制酶的切割频率，理论上应为1／4n，n 表示该限制酶识别的碱基数。如识别4 个碱基
的限制酶，其切割频率应为每256 个碱基有一个识别序列和切点（1／44 = 1／256），识别5 个碱基的
限制性内切核酸酶，其切割频率应为每1024 个碱基有一个识别序列和切点，余类推。 5．什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素的影响?
答：II 类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在
一定环境条件下表现出来的特异性。条件发生改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都 有一些改变。改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加
一个星号表示，因此第二活性又称为星号活性。
诱发星号活性的因素有如下几种：①高甘油含量(＞5％，v／v)；②限制性内切核酸酶用量过高(＞
100U／gDNA)；③低离子强度(＜25mmol／L)；④高pH(8．0 以上)；⑤含有有机溶剂，如DMSO、乙
醇等；⑥有非Mg2+的二价阳离子存在（如Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等）。 6．双酶消化法（double digest）绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理是什么?
答：双酶消化法是绘制DNA 中两个或两个以上限制性内切核酸酶图谱所采用的方法。做法是在两
个限制性内切核酸酶分别单独消化DNA 分子的基础上，再用这两个酶同时或先后消化DNA，根据它
们的结果构建物理图谱。
7．什么是DNA 多态性 (DNA polymorphism)? 答：在正常人群中，各个体DNA 分子的某些位点可以发生中性改变，这些改变虽然会使DNA 一
级结构产生一定变化，但不影响基因的表达，如果这种中性突变在人群中的频率不低于1％，这一现象
被称为多态性。DNA 多态性本质上是染色体DNA 中核苷酸数目或排列顺序的个体差异，
这些差异多
数为中性突变，不引起表型改变。
8．什么是限制性片段长度多态性 (restriction fragment lengt hpolymorphism，RFLP)？
答：当DNA 序列的差异发生在限制性内切核酸酶的识别位点时，或当DNA 片段的插入、缺失或
重复导致基因组DNA 经限制性内切核酸酶酶解后，其片段长度的改变可以经凝胶电泳区分时，DNA
多态性就可应用限制性内切核酸酶进行分析，这种多态性称为限制性片段长度多态性(RFLP)。
9．计算下列三种酶各自在某染色体DNA 序列上识别位点间的平均距离：
Alu I：5’ AGCT 3， EcoR I: 5’GAATTC 3’
3’TCGA 5， 3’CTTAGG 5’
Acy I：5’GPuCGPyC 3’
3’CPyGCPuG 5’
(注：Py=任何一种嘧啶；Pu=任何一种嘌呤)
答：Alu I：(1／4)4=1／256 EcoR I：(1／4)6=1／4096
Acy I：(1／4)4(1／2)2=1／1024
10．何为回文序列？ 答：回文序列（palindromic sequence）是一段自我互补的序列，即同其互补链一样的序列（两者的
阅读方向都是从5’→3，)。
根据回文序列的结构可分为：完全的回文序列、不完全的回文序列和间断的回文序列。完全回文
序列（如GAATTC），通常是限制性内切核酸酶的识别序列；不完全的回文序列（如TACCTCCAT,
CGTGATA），常是其他蛋白质的结合位点(如阻抑蛋白)，在基因表达调控中有重要作用；间断的回文序
列（如GGTTXXXAACC，有一段是颠倒的重复），它可使单链的核苷酸有可能在tRNA 中所见到的一
样，形成发夹环的结构。
聚合酶与修饰酶
一、填空题
1、连接酶（ligase）是一类用于核酸分子连接形成 磷酸二酯 键的核酸合成酶。
2．原核生物主要有两种类型的DNA 连接酶：E．coli DNA 连接酶和T4 DNA 连接酶。基因工程中使
用的主要是T4 DNA 连接酶，它是从T4 噬菌体感染的E．coli 中分离的一种单链多肽酶，分子质量
为 68 kDa，由T4 噬菌体基因 30 编码。E．coli DNA 连接酶是由大肠杆菌基因 51 编码，也是一
条多肽链的单体，分子质量为 74 kDa。这两种DNA 连接酶有两个重要的差异：①它们在催化反
应中所用的能量来源不同，T4 DNA 连接酶用 ATP ，而E．coli DNA 连接酶则用 NAD+作为能源；
②它们催化平末端连接的能力不同，在正常情况下只有T4 DNA 连接酶能够连接平末端，
E．coli DNA 连接酶则不能。即使是调整反应条件，E．coli DNA 连接酶催化平末端的连接效率也只有T4
DNA 连接酶的 1/10 。
3. 从小牛胸腺中分离纯化的末端转移酶催化的基本反应是将 脱氧单核苷酸加到DNA 的3’-ON 端 ，
同时释放出游离的无机磷。催化反应时不需要 模版 ，但需要引物，单链DNA 是最好的引物，单
链DNA 受体的长度最短需有 3 个dNTP。具有3’突出末端的双链DNA 也是较好的反应底物。二
价离子和DNA 末端状态对催化反应影响较大，但是用Co2+ 作为辅助离子，可以催化任何形式的末
端 （突出的、隐含的、平齐的）加接单核苷酸，但突出的3’端效率较高。以Mn2+／Mg2+作为辅
助因子，只能在单链DNA 或双链DNA 的3’突出端加尾。
4． DNA 聚合酶I 的Klenow 片段是用 枯草杆菌蛋白酶 切割DNA 聚合酶I 得到的分子质量为76kDa
的大片段，具有两种酶活性：① 5’→3’聚合酶活性 ；② 3’ →5’外切核酸酶 的活性。 5．反转录酶除具有以DNA 和RNA 为模板合成DNA 的5’→3’合成酶的活性外，还具有四种酶的活
性：① 5’→3’ 外切核酸酶活性；② 3’ →5’外切核酸酶活性 ；③ DNA 内切酶的活性（Mn2+，
切割SC DNA）； ④ 解旋酶的活性 。
__________6．为了防止DNA 的自身环化，可用 碱性磷酸酶 脱去双链DNA 5’端得磷酸基团 。
7．切口移位(Nick Translation)法标记DNA 的基本原理在于利用 DNA 聚合酶I 的 5’→3’外切核酸
酶 和 5’→3’聚合酶活性的作用。
8．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA 分子转变成平末端的双链形式，通常可采用 S1 核酸酶切
割 或 DNA 聚合酶补平。
9．反转录酶除了催化DNA 的合成外，还具有 核酸水解酶H 的作用，可以将DNA-RNA 杂种双链中