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组织细胞破碎技术方法简介
细胞破碎，即破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内或亚细胞产物最大程度的释放或转移到液相。以便浸提出来进行后续的操作。
技术方法:化学法：渗透冲击、酶消化法、增溶法、脂溶法、碱处理法
机械法：捣碎机法(片型匀浆法)、 研磨法、超声波法、匀浆法(孔型匀浆法)、 珠
磨破碎 思考题
1 常用的细胞破碎的方法有哪些？ 机械法，酶法，化学法，物理法
2 有机溶剂法破碎细胞原理，常用的有机溶剂有哪些
有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳。比如笨、甲苯、氯仿、二甲苯及高级醇等
层析技术方法简介
层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动根据交换剂的属性、层析的分离的原理可将层析分类如下相，从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。
分类（1）分配层析
（2）离子交换层析 （3）凝胶过滤层析 （4）亲和层析 （5）吸附层析
一、离子交换层析
㈠基本流程 上样：
洗脱：pH梯度洗脱；或离子强度梯度洗脱 检测、记录分部收集。 ㈡离子交换分离基本原理
不同氨基酸（蛋白质、酶、蛋白激素等）等电点不同，在同pH条件下带电性能不同，与交换剂结合力大小不同，结合较松的先被洗脱出来，结合较紧的后被洗脱出来，从而被分开。
阳离子交换剂交换原理：
+ +
RC-C1++C2RC-C2++C1
㈢离子交换层析过程中的关键技术 1、交换剂处理
①漂洗 目的是除去杂质用倾倒法除去细小颗粒（这一步一定要到做位。留下细小颗粒会堵塞层析柱下的尼龙网眼。）直至水清澈无色。
②处理 用酸碱轮换浸泡，以便使交换剂带上需要的平衡离子。 ③平衡 经处理后，要用大量的水悬浮交换剂，最后用缓冲液平衡 2、柱的选择与装柱
装填均匀，松紧一致，没有气泡，没有裂缝。 3、上样要求
加入样品液的体积一般应小于床体积的1/3。 4、洗脱剂
原则四条：①阴离子交换剂选用阳离子缓冲液（如氨基乙酸、铵盐、Tris等），阳离子
交换剂选用阴离子缓冲液（如乙酸盐、磷酸盐等），以防缓冲离子参与交换过程，降低交换剂的交换容量。②缓冲液pH值的选择要使被分离物质的电荷与平衡离子电荷的正负性相同。③选用的缓冲系统对分离过程无干扰。④要确定一定的离子强度。
5、洗脱速度
洗脱速率太快和太慢都会降低分辨率。 二、凝胶过滤层析
1、原理：在凝胶颗粒所构成的立体的网状结构中，蛋白质的分子颗粒越大，受到凝胶颗粒的排阻越大，下行越快，优先洗脱出来；分子颗粒越小受到的排阻越小，阻力越大，洗脱出来的速度越慢。
2、 常用凝胶：
(1)天然凝胶：琼脂糖凝胶 (2)人工合成凝胶:
葡聚糖凝胶（其商品名称Sephadex），有G-25，G-75，G-100 ，G-200等型号的凝胶。其中G后面的数据为得水值，即每g干胶吸水毫升再乘以10. 不同规格的凝胶性质不同，常用G-25脱盐。
3、 应用： (1)分离、纯化与鉴定； (2)测定相对分子质量； 三 亲和层析
1、原理：利用生物大分子间专一亲和力的层析技术。
2、应用： 酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅因子、抗原与抗体、激素与其受体。 四 吸附层析
1、原理：利用各种成分被表面具有吸附分子特性的固体的吸附程度及其在分离溶剂中的溶解度差异进行分离，取决于物质的分子结构。
2、分类：
(1)物理吸附，如：活性炭； (2)化学吸附，如：氧化铝； (3)交换吸附，如：硅胶。 思考题：
1.什么叫层析技术？常用的层析技术有哪些？
层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动相，从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。常用技术有分配层析，离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和层析，吸附层析 2.指出常用层析技术的应用范围。
凝胶层析法：⑴脱盐；⑵用于分离提纯；⑶测定高分子物质的分子量；⑷高分子溶液的浓缩
离子交换层析法：主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子
高效液相层析法：⑴液-固吸附层析；⑵液-液分配层析；⑶离子交换层析 3．SephadexG-100凝胶柱层析分离蛋白质原理是什么？ 大小不同的分子经过的路线长短不同而达到分离作用 4.用Sephadex G25脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰？ 蛋白质
5.相对分子量为8万和10万的蛋白质能否在SephadexG-75柱中分开？为什么？ 不能,分子量差距太小
6.将分子量分别为a（90 000）、b（45 000）、c（110 000）的三种蛋白质混合溶液进行凝胶过滤层析，正常情况下，将它们按被洗脱下来的先后排序。 c、a、b
7.离子交换层析与凝胶过滤哪种分辨率高？ 离子交换层析较高。
8.离子交换层析的原理？
根据自交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离
主要依赖电荷间的相互作用,利用带电分子中电荷的微小的差异进行分离
9.如果样品中只有Ala和His(Ala pI=6.0,His pI=7.6)，在pH4条件下，这两种氨基酸那一种与CM（阳离子交换剂）结合的紧密？如果用pH4-7的洗脱液梯度洗脱，那种氨基酸先洗脱出来？ Ala
10. 柱层析时湿装柱的注意事项有哪些？ 用水灌注、不能有气泡
11.说说离子交换层析中洗脱液的选择原则
①阴离子交换剂选用阳离子缓冲液（如氨基乙酸、铵盐、Tris等），阳离子交换剂选用阴离子缓冲液（如乙酸盐、磷酸盐等），以防缓冲离子参与交换过程，降低交换剂的交换容量。②缓冲液pH值的选择要使被分离物质的电荷与平衡离子电荷的正负性相同。③选用的缓冲系统对分离过程无干扰。④要确定一定的离子强度。 12.如何利用凝胶过滤层析测定蛋白质相对分子质量
电泳原理与技术
目前常用的电泳系统为区带电泳。
任何电泳技术方法，均是以某种载体或支持介质作为样品中蛋白质的泳动跑道，常见凝胶电泳的支持介质有（1）聚丙烯酰胺凝胶（2）琼脂糖凝胶（3）淀粉凝胶。
一 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （一）PAGE技术流程简介
1.组架（玻板、胶条、U型玻板、封胶）
2.制胶（分离胶溶液、浓缩胶溶液、插入梳子） 3.点样 4.电泳 5.染色 6.脱色 7.分析 （二）丙烯酰胺凝胶聚合原理与凝胶结构
1、聚合原理：聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是用丙稀酰胺和交联剂甲叉双丙烯在催化剂的作用下聚合而成。通常采用过硫酸铵或核黄素来引发该过程,以N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(Tetranmethylenediamine,TEMED)为增速剂。该引发-增速的催化系统实质是自由基催化的氧化-还原过程。聚合好的凝胶是立体网状结构。
2、凝胶浓度和蛋白质分子量的关系
凝胶中网眼的大小与胶的浓度有关，凝胶的浓度越小，其网眼越大，胶的浓度越大网眼越小。分离分析较小的蛋白质分子时用较高浓度的凝胶，而分离分析分子量较大的蛋白质时则用较大浓度的凝胶。
（三）影响凝胶聚合速度主要因素
1、引发剂和增速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在40~60分钟内完成。
2、系统pH值 酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果。
3、温度 低温下聚合导致凝胶变脆和混浊；适当提高温度可以是凝胶透明而有弹性； 4、分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气。 5、系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合； （四）PAGE分离蛋白质原理
PAG系统电泳分离蛋白质具有很高的分辨率，因为该系统工作状态下存在三种效应。 1浓缩效应 指样品在进入分离胶之前被浓缩成一条细线的现象。（1）在电泳系统中有含甘氨酸的Tris-HCl(pH8.5)电极缓冲液，浓缩胶pH6.5，通电后样品中的各种带负电荷
--的蛋白质会在快离子(Cl)和慢离子(0.1%Gly)形成的高压带之间初步分开并形成很窄的条带，而使整个样品中的蛋白质在将进入分离胶时会形成一条细线，即被浓缩之效果。（2）蛋白质样品从网眼较大的浓缩胶进入网眼较小的分离胶时遇到的阻力突然变大。
2.电荷效应 在设置好的浓缩胶及分离胶特定pH条件下，不同蛋白质所带电荷多少不同，并在稳定的静电场中向异极泳动的动力所决定的泳动速度不同，最终会被分离。
3.分子筛效应 分离胶内属于立体的网状结构，分子量较大的蛋白质颗粒向异极泳动受到的阻力较大，泳动较慢，而分子量较小的蛋白质则阻力较小，向异极泳动较快，最终被分开。
（五）影响蛋白质泳动速度及分离效果主要因素 1.系统的pH值
凝胶体系及电极缓冲液的pH决定样品中蛋白质的带电性质，直接影响蛋白质的电泳方向和泳动速度。pH一般设置成大于样品中蛋白质的等电点，蛋白质均荷负电，电泳方向朝阳极。而当pH小于样品中蛋白质的等电点时，则所有蛋白质分子荷正电，静电场中向阴极泳动。前一种电泳系统属于碱性电泳，后者成为酸性电泳。
2.电场强度
普通电泳 5~20V/cm电压降(电位梯度)。 高压电泳 70~00V/cm电压降(电位梯度)。 3.温度
电泳过程中由于电流作用致使凝胶发热，热效应对电泳有很大影响。温度升高时介质粘度下降，分子热运动加剧，自由扩散变快，有效迁移率增加，但对于蛋白质分离不利。另外较高温度会使凝胶变形，分子筛效应降低，影响分离。因此，一般要求在15-25℃之间进行电泳效果较好。
4.电渗作用
电泳介质或支持物(如凝胶)在电极缓冲液中吸附带电离子，使溶液相对带电，进而在电场作用下，溶液就会向一定方向移动，这种想象称为电渗现象。带电溶液的移动会影响蛋白质的泳动。
二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE:十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳） （一）SDS-PAGE 分离基本原理
SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。因此，SDS-PAGE过程中蛋白质分