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5～6范围比较稳定，p H大于 7活性急剧下降，且该溶菌酶p H 6左右时最稳定，在 p H 5.3-6．9范围内相对稳定。初步说明该溶菌酶在偏酸性环境下比较稳定。这与大部分文献报道基本一致。这也为将溶菌酶制成 p H 5 ～7的液体制剂提供了依据。【7】
（2）最适温度： 方法：蛋清溶菌酶最适作用温度的测定：在ｐＨ值６．２的相同磷酸盐缓冲液中，分别在不同温度下测定溶菌酶酶活性。
（3）热稳定性：
溶菌酶作用的最是温度在35-50摄氏度，最是温度37摄氏度，适宜PH5.3-7.4，最适PH6.8，水溶液在3-11之间是稳定的。具有较强的热稳定性，在PH4-8时，100摄氏度的条件下处理1分钟酶仍保持90%以上。【6】
四：提取原材料和提取方法:
溶菌酶广泛存在于家禽的蛋清、哺乳动物组织的分泌液中，一些植物（如卷心菜、木瓜等）的汁液中也有强力的溶菌酶活性。目前一般从蛋清和蛋壳中提取溶菌酶。
提取原料：鸡蛋（含量约为2%到4%）。鸡蛋清按水分和固形物所占比重，则含水分87%，固形物13%；固形物中大约90%是蛋白质。 【15】
提取方法：
①蛋清中溶茵酶的提取：蛋清中的溶菌酶可用吸附法提取，过程如下：蛋清过滤（９０目 １００目），加入７２４型树脂吸附（每 公斤蛋清加１５ｇ）一倾去蛋清一冲洗并控干树脂。用质量分数１０％硫酸铵洗脱一洗胶液中加入晶体硫酸铵（３０ｇ／１００ｍＬ）沉淀溶菌酶，沉淀晾干即得到溶菌酶粗制品。 蛋清中的溶菌酶也可用直接结晶法制取，即在蛋清中加入食盐（ＮａＣＩ）。使其质量分数达到５％，并调节溶液ｐＨ值至１０．０左右，加入少许溶菌酶晶体为晶种，于-４摄氏度冰箱冷却静置７ｄ一１４ｄ即可获得溶菌酶的结晶品。这种工艺方法可获得较高纯度的溶菌酶，收率也比较高。可广泛用于从蛋清提取溶菌 酶的工业化生产。
②蛋壳中溶茵酶的提取：蛋壳中（实际上是蛋壳膜）溶菌酶含量虽然较低，但从变废为宝的角度考虑，仍是提取溶菌酶的重要原料。具体工艺流程如下：蛋壳一质量分数１％ＮａＣＩ抽提滤液加热去除杂蛋白，加聚丙酸凝聚（富集），溶解凝聚物，加氯化钙沉淀上清液结晶。
③菜心叶子高速捣碎后，滤液经酸碱处理，硫酸铵分步沉淀，凝胶柱层析等步骤分离纯化溶菌酶，酶比活力达３４１４．６Ｕ／ｍｇ，纯化倍数为１９７．４。菜心溶菌酶在较宽的温度或ｐＨ值范围均有活性，最适温度为６０℃，最适ｐＨ值为５．８，底物Ｋｍ值为８７μｇ／ｍＬ。该酶对热和酸碱的稳定性较高，巯基和酪氨酸残基不是该酶活性中心的必需基团。【11】
④从海参肠中分离纯化溶菌酶,并测定其酶学性质及抑菌作用。在4℃下将海参肠打浆,用Tris2HCl缓冲液抽提。上清液经浊点萃取法(CPE)浓缩、阳离子交换柱(CM52纤维素)层析和SephadexG275凝胶过滤层析分步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。该酶的比活力达到3026.1U/mg,纯化倍数为18.7,活力回收为46.0%。对纯化的溶菌酶性质研究表明,该酶相对分子质量约为16000,对溶壁微球菌的最适作用温度为35℃,最适作用pH6.5,在45℃以下和pH4.0～8.0都有较好的稳定性,并与常见金属离子和化学试剂有良好的配伍性。与通常从蛋清中提取的溶菌酶相比较,从海参中分离纯化的溶菌酶具有广谱杀菌功能,即对常见的革兰氏阴性菌和阳性菌细胞壁均有溶解作用。【12】
五：溶菌酶的提取，分离，纯化：（重点）：
工业上多采用直接结晶法，亲和色谱法，离子交换法，超滤与亲和色谱连用法等生产溶菌酶。根据Vaidya报道，采用N-异聚丙烯酰胺与酸性单体的共聚体从蛋清中热沉淀溶菌酶，得到90%的收率。【9】
①结晶法：
结晶法是一种传统的制备溶菌酶的方法，通过改变溶液条件，使溶菌酶以结晶态析出。以王敏的制备卵清溶菌酶实验方法为例，介绍结晶法制备溶菌酶： 结晶法分离溶菌酶的产率一般为60％～80％ 。
这种方法操作简单，应用于卵清溶菌酶结晶品的工业生产，使产品的成本大大降低，为其医药应用作出了贡献。但是其生产周期较长，产率相对偏低，高纯度产品获取过程复杂；另外此法不能用以分离微量的溶菌酶。
②离子交换法：
离子交换法一直以来都是溶菌酶生产所常用的方法，它是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作技术，具有简便、高效、成本低，且可自动化连续操作的优点，陕西科技大学的宋宏新等人采用弱酸
性阳离子交换树脂(724树脂)动态交换洗脱纯化工艺对鸡蛋壳中的溶菌酶进行分离，具体工艺如下：
分离过程中采取动态交换方法，即树脂装柱后抽提液缓慢流入柱中，用缓冲液洗涤，再用硫酸铵溶液洗脱。结果表明724树脂的吸附率达到83．5％。
③色谱技术：
色谱分离技术有多种类型，其中膜色谱技术是将液相色谱与膜分离结合起来的一种新技术，具有快速、高效、高选择性、易于放大的特点，能满足生物大分子高效分离与纯化的要求，它作为一种高效的分离纯化技术已受到人们的高度重视，广泛地应用于大分子物质的纯化。柯从玉研制出一种简易型色谱柱并通过装填大颗粒的疏水色谱填料对色谱柱的性能进行了考察，该柱的外形和操作如同传统的液相色谱柱，但它却在生物大分子分离方面有着和高效液相色谱相似的分辨率。另外，只要给该柱装填合适的固定相，比如疏水相互作用色谱固定相，便可用于蛋白质的复性及同时纯化。
高速逆流色谱技术是一种无固体载体的连续液一液分配色谱技术，其固定相通过重力场和离心力作用被保留在分离柱内，避免了固体载体与样品发生化学反应而不可逆吸附，样品回收率高，郅文波等人利用多分离柱高速逆流色谱，研究聚乙二醇1000(PEG1O00)一磷酸盐双水相体系的固定相保留率及该体系对蛋白质混合物进行分离，以14％PEGIO00—16％的磷酸盐体系的上相为固定相，在流速0．6tool／rain和转速900r／rain的条件下，根据细胞色素c、溶菌酶、和血红蛋白三者的分配系数的不同对其进行分离，三者的收率均大于90％。其色谱洗脱曲线见图
毛细管等电聚焦和电渗泵驱动聚焦色谱分离也引起了研究界的普遍重视，舒馨等人建立了一种利用电渗泵驱动毛细管内的聚焦区带，实现毛细管电泳等电聚焦分离蛋白质的方法。该方法在考察对牛血清白蛋白和溶菌酶两种粗提蛋白质混合物的分离，迁移时间的RSD分别为1.6％和1.3％ ，峰面积的RSD均为1.6％。
④酸性条件下热处理法提纯溶菌酶：
在酸性条件下溶菌酶具有热稳定性，不易变性失活，且溶菌酶和卵蛋白的等电点分别为11.0和4.5，由于溶菌酶和卵蛋白的性质著异，因而在实验中采用热变性和调pH值使卵蛋白沉淀的方法来探讨去除卵蛋白的较好方法。研究发现溶菌酶和卵蛋白之间存在静电作用力，在加热以及调等电点来除卵蛋白的时候溶菌酶会随卵蛋白一起沉淀。加入磷酸盐缓冲液后经热处理和调pH值到卵蛋自等电点，沉淀中不再含有溶菌酶，实验证明加入磷酸盐缓冲液可以去除溶菌酶和卵蛋向之间的静电作用力。研究得出去除卵蛋白效果最好的时候是在pH=7.5的磷酸盐缓冲液的条件下，100°C下热处理2min，上清中溶菌酶纯度可达到67.17%，远高于其它条件的磷酸盐缓冲液以及碳酸氢钠缓冲液条件下的处理效果。该方法虽然简单成本低，但是也造成蛋清余液无法重复利用，加人了实际生产成本。
⑤超滤法提纯溶菌酶：
超滤法是利用膜两侧的压力差，使小分子透过膜，而大分子物质留在膜内不能透过，从而实现对酶的浓缩精制。超滤法的优点有不易引起酶变性失活．而且操作比较方便。溶菌酶分子量14000-15000Da，相对卵清蛋白分子量45000Da是一类分子量较小的物质。因此本实验用截留量的膜提取溶菌酶获得了较好的效果，但是超滤法在实际操作过程中超滤时间过长，超滤膜易堵塞，这限制了它进行溶菌酶工业化生产的利用。
⑥溶菌酶的磁性亲和分离：很多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子
可逆地特异结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物专一吸附技术”或“功能层析技术”。它具有分离快速，纯化效率高。特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。磁性介质被广泛用于分离细胞、核酸蛋白质等生物大分子和激素等小分子生物活性物质，其优点在于通过外磁场的作用可快速地实现固液及磁性介质与其它固形物间的分离，尤其是当待分离的液体样品含有其它固形物或粘度较大时。磁性亲和分离技术是将亲和吸附的专一性、高效性与磁性材料的磁可导向性相结合的一种新型分离技术。
⑦膜处理技术
膜处理技术主要是在一定的驱动力下，使溶液通过一定孔径的膜，以达到分离的目的。运用膜处理技术可以很好地通过调节而获得高产量和高纯度的产品，如果在无菌条件下操作，可以直接生产无菌的溶菌酶溶液，直接用于临床治疗。如今，人们在传统的膜处理的基础上，将固定离子亲和色谱与膜分离结合制备具有分离性能的固定金属亲和膜用于分离纯化蛋白质。
⑧其他分离纯化技术 （1）反胶团萃取
反胶团是表面活性剂分子溶于非极性溶剂中自发形成的聚集体，其中表面活性剂的极性头朝内而非极性头朝外与有机溶液接触。胶团内可溶解少量水而形成微型水池，蛋白质、核酸、氨基酸等生物物质溶解在其中，由于胶团的屏蔽作用，这些生物物质不与有机溶液直接接触，起到保护生物物质活性的作用，从而实现生物物质的溶解和分离。该技术得到广泛关注，但由于该体系含有较高浓度的表面活性剂，界面张力低，易乳化在萃取过程中，水相离子强度一般较低，传质速度慢，分相困难。
（2）膨胀床吸附法
膨胀床吸附技术能直接从未经固液分离的生物产品料液中捕集目标产品，集固液分离、吸附纯化为一体，是一个过程集成的操作，可以直接从含有细胞或细胞碎片等固体颗粒的高粘度料液中分离纯化目标产物。【10】
六：纯度测定：
蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学方法，如：电泳、HPLC等。其中常用的电泳分析方法有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、等电聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等。纯的蛋白质在一系列条件下进行电泳时，都将以单一的速度泳动，它的非变性电泳图谱应只呈现一条染色带。HPLC常用于多肽、蛋白质纯度鉴定，纯的蛋白样品在洗脱图谱上呈现出单一的对称峰。 电泳结果分析： （1）根据电泳图谱分析溶菌酶的纯化情况。
（2）根据标准蛋白的分子量和迁移率及目的蛋白的迁移率，计
算目的蛋白的分子量（以lgM对迁移率R作图，其中M为蛋白质分子量）。
参考文献：
【1】溶菌酶的性质及其在食品防腐中的应用，张新宝，陈红兵； 【2】维普资讯 溶菌酶的研究现状 李鹤，马力；