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实验七 用菌落计数法测水中细菌总数
一、目的要求
1、学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。 2、了解源水的平板菌落计数的原则。 二、基本原理
平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。（平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于其最大的优点是可以获得活菌的信息，所以广泛应用于生物制品检测，食品、饮料和水等的含菌指数或污染程度的检测）
本实验是用源水的平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。
三、实验器材
1、水源水（河水），灭菌蒸馏水，工业酒精。 2、培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。 3、仪器或其他用具：酒精灯（芯）、火柴、灭菌的带玻璃塞的三角瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管（10ml,1ml），灭菌试管、试管架、生化培养箱等。
四、操作步骤 1、水样的采取
水源为盐城工学院化工楼西侧河水，采取方法：应去距水面10～15cm 的深层水样，先将灭菌的带塞三角烧瓶瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。
2、细菌总数测定
①写标签：每组同学取6套灭菌培养皿和4个灭菌试管分别写标签（试管为1组，分别编号为10-1，10-2，10-3，10-4，培养皿分2组，分别对应编号为10-2，10-3，10-4）
②水样的稀释与接种 取4个灭菌试管，分别用10ml的灭菌吸管加入9ml灭菌水。用1号1ml灭菌吸管取1ml水样注入第一管9ml灭菌水内、摇匀，再用2号1ml灭菌吸管自第一管取1ml至下一管灭菌水内，摇匀，并立即取1ml稀释水加入空的对应编号的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。如此稀释到第三管、第四管（稀释度分别到0.1、0.01、0.001、0.0001），并接种到对应编号的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。
稀释倍数看水样浑浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30～300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计算或少到无法计算，则需继续稀释或减少稀释倍数。一般中等污秽水样，取0.1、0.01、0.001三个连续稀释度，污秽严重的取0.01、0.001、0.0001三个连续稀释度（根据试做实验，本实验取0.1、0.01、0.001这三个稀释度为宜）。
③向每个培养皿中各倾约15ml已溶化并冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌子上摇匀。
④凝固后倒置于37℃培养箱中培养48h。 3、菌落计数方法
（1）先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。
（2）首先选择平均菌落数在30～300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。
（3） 若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则去其中较小的菌落总数。
（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。
（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。
（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。
不同稀释度的平均菌落数 两个稀释例次 度菌落数菌落总数（个/ml） 备注 0.1 0.01 0.001 之比 1 1 365 164 20 ? 16 400或1.6×104 两位以2 2 760 295 46 6.4 29 500或3.0×104 后的数3 2 890 271 60 4.5 27 100或2.7×104 字采取4 无法计数 1 650 513 ? 513 000或5.1×105 四舍五入的方5 27 11 5 ? 270或2.7×102 6 无法计数 305 12 ? 30 500或3.1×104 法去掉 五、原始数据记录与数据处理 1、原始数据记录： 水样来源：
每组同学稀释用试管数和接种水样的培养皿数 2、数据处理： 稀释度 0.1 0.01 0.001 平板 1 2 1 2 1 2 菌落数 平均菌落数 计算方法 菌落总数/ml
六、思考题
1、要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？ 2、你所测的水源的污秽程度如何？
3、试比较平板菌落计数衍和显微镜直接计数法的优缺点及应用。
实验八 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别
一、目标要求
1、观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。 2、掌握酵母菌的一般形态特征及其细菌的区别。 二、基本原理
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖。本实验通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母菌的形态和出芽生殖方式。
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝有蓝色的氧化型变成无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。
三、实验器材
1、菌种：酿酒酵母新鲜平板菌悬液、干酵母粉菌悬液
2、染料：0.1%吕式碱性美蓝染色液和0.05%吕式碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液
3、其他：显微镜，载玻片，盖玻片、小标签、吸水纸 四、操作步骤
1、美蓝浸片的观察
（1）在载玻片中央加一滴0.1%吕式碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。
染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。
（2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。
盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。
（3）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。
（4）染色约0.5h后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。 （5）用0.05%吕式碱性美蓝染色液重复上述操作。 2、水一碘液浸片的观察
在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。
五、原始数据记录与数据处理 1、原始数据记录：
绘图说明你所观察的酵母菌的形态，颜色和数量。 2、数据处理：
根据观察结果，说明不同染色时间和不同染液浓度对酵母菌死、活数量的变化。 六、思考题
1、吕式碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。
2、在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别与一般细菌？