发布时间 : 星期日 文章微生物学实验备课笔记发更新完毕开始阅读
皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15m L，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝固后即为平板。
3、接种
1）斜面接种法(参见P76) 2）平板接种法(参见P72)
A、点燃酒精灯。
B、挑菌落：右手持接种针柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧灭菌后，用左手将菌种平板培养基（简称菌种板）将皿盖在火焰附近打开一缝，以杀灭可能玷污的微生物。将灼烧的灭菌的接种针伸入菌种板内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从平板上刮取少许菌苔取出。
C、接种：
1）接种平板：左手迅速放下菌种板，在火焰附近迅速拿起待接种的新鲜平板培养基（简称接种板）。右手中接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种板。用接种针在平板上自平板底部向上端轻轻地作“之”字划线：先在平板培养基的1/2的一边做第一次划线，再转动培养皿，在1/4的一边做第二次划线，再转动培养皿，在剩下的1/4的一边做第三次划线。（或每次作“平行”划线3或4条，再转动培养皿约70度，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分做第二次平等划线，再用同样的方法通过第二次划线部分做第三次平等划线和通过第三次划线部分做第四次平等划线（见P73图6），此法在实际操作上不易把握，易出现接种不到微生物的可能，故推荐同学统一划“之”字形）
接种完毕，接种针应通过火焰抽出平板，并迅速盖上皿盖。再重新仔细灼烧接种针后，放回原处。将接种板放入培养箱中置于37 ℃培养24-48小时。
注意：①为了尽可能多地得到单个菌落，在挑菌落时一定要尽量少挑，同时在划线时要尽量划得长些、多些。
②每次转动培养皿时都要在火焰附近，且不要将接种针拿出培养皿外。 2）接种斜面：左手迅速放下菌种板，在火焰附近迅速拿起待接种的新鲜斜面
培养基（简称接种管）并松开管帽或拔下棉塞，注意保持斜面向上并使管口略向下倾斜。右手中接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管中。用环在斜面上自试管底部向上端轻轻地划一直线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞（或盖上管帽）。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处。将接种管放入试管架后置于37 ℃培养箱中培养。
注意：所划直线尽可能的直，切莫划几条线或蛇形，不要将培养基划破，也不要使接种环接触管壁或管口。 3）液体接种法（略讲，学生不做） 4）穿刺接种法（略讲，学生不做） 4、培养与观察
将上述已接种的平板和斜面放置于37℃培养箱内培养1-2d后取出对照P75细菌的培养特征图进行观察。 五、原始数据记录与数据处理
1、原始数据记录：
所接种的两种微生物：大肠杆菌和金黄葡萄球菌的平板培养物。 每位学生的接种要求：两种微生物各接种一皿。 2、数据处理： 平板上 样品名称 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 菌落 1 2 1 2 特 征 描 写 大小 形态 干湿 高度 透明度 颜色 边缘 在斜面上 样品名称 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 菌苔 1 2 1 2 形态 特 征 描 写 透明度 颜色
六、思考题
1、用斜面检测微生物的培养特征接种时，为什么不要划多条线或蛇形，而只要划
一条直线？ 2、接种环(针)接种前后灼烧的目的是什么？为什么在接种前一定要将其冷却？如
何判断烧过的接种环已冷却？ 3、试述如何在操作中贯彻无菌操作的原则？
实验六 革兰氏染色法
一、目的要求
1、学习并初步掌握革兰氏染色法。
2、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、基本原理
革兰氏染色将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的，革兰氏阳性细菌细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫——碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性不同，由于细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高。所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫——碘的复合物比较容易被洗脱，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分重要的。
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物。
2、试剂：革兰氏染色液，95%的乙醇，灭菌蒸馏水（生理盐水）
3、仪器或其他用具
酒精灯（芯）、火柴、接种环（针）、圆头镊子、滴管、记号笔、载玻片、吸水纸、洗瓶、显微镜、香柏油、擦镜纸、小标签
四、操作步骤 1、制片 （1） 涂片
取两片载玻片，各滴一小滴生理盐水于玻片中央，用接环以无菌操作分别从枯草杆菌和大肠杆菌的斜面上挑取少许菌苔于水滴中混匀并涂成薄膜。若用菌悬液涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上。
要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性
（2）干燥 室温下自然干燥 （3）固定
涂面朝上，通过火焰2～3次。
此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，病使之牢固附着在载玻片上。
热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。 2、初染
滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1～2min，水洗。
3、媒染
用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。 4、脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约20～30s。
5、复染
用番红液复染约2min，水洗 6、镜检
干燥后，用油镜观察。
菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。 7、混合涂片染色
按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄色葡萄菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。
五、原始数据记录与数据处理 1、原始数据记录：
进行革兰氏染色的微生物菌种：大肠杆菌和金黄葡萄球菌的新鲜斜面培养物。 每组同学的染色要求：单一微生物染色和混合微生物染色各一片，在油镜下观察，绘图并记录微生物的形态和颜色。
2、数据处理：
根据所观察到的染色结果，说明两种微生物分别是何种革兰氏染色反应。
六、思考题
1、你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 2、你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。
3、革兰氏染色时，初染前加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？