发布时间 : 星期六 文章微生物学实验备课笔记发更新完毕开始阅读
实验三 微生物学实验室常用器皿的清洗、包装与干热灭菌
一、实验目的
1、了解微生物学实验室常用的器皿和工具的种类、要求和应用。 2、掌握微生物实验室常用的玻璃器皿的清洗及包装方法。 3、了解干热灭菌的原理和应用范围。 4、掌握干热灭菌的操作技术。 二、基本原理
微生物学实验所用的器皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。玻璃器皿的形状和包装方法要求能防止污染杂菌为准；玻璃器皿的洗涤方法根据实验目的、器皿的种类、所盛的物品、洗涤剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同。清洗后的玻璃器皿、经包装后即可进行干热灭菌。 干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种（P59）。火焰烧灼灭菌适用于载玻片、试管口、玻棒、接种工具和金属用具如镊子等的灭菌。通常所说的干热灭菌是在电烘箱内利用高温干燥空气使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。而细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固变越快，反之反之。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160－170℃），时间长（1-2h）.但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。培养基、橡胶制品、塑料制品、衣物等不能用干热灭菌。 三、实验器材 微生物实验室常用的器皿、接种工具、电热鼓风干燥箱等 四、操作步骤 1、微生物实验室常用的器皿简介（P2－6） 试管、吸管、培养皿、三角烧瓶、载玻片、盖玻片、双层瓶、滴瓶、接种工具等。
2、微生物实验室常用的器皿清洗方法（P6） 1）新玻璃器皿的洗涤方法（P6）；
2）使用过的玻璃器皿的洗涤方法（P6）。 3、空玻璃器皿的包装（P7－8） 1）培养皿的包装； 2）吸管的包装；
3）试管和三角烧瓶的包装
注意：做棉塞的方法（P53－54）
4、包装过的玻璃器皿的干热灭菌方法（P62-63）
装入待灭菌物品；升温；恒温；降温；开箱取物；无菌检查。 五、原始数据记录与数据处理 1、原始数据记录
领用了哪些玻璃器皿、清洗了哪些玻璃器皿、包装了哪些玻璃器皿。 2、数据处理
清洗效果、老师评价；包装效果、老师评价；干热灭菌条件及结果。
六、思考题（P63）
1、为什么在吸管的包装时要在其粗端吸管口塞上一小段棉花？ 2、在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？
3、为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高，时间长？
实验四 培养基的制备及高压蒸汽灭菌
一、实验目的
1、明确培养基配制原理
2、通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。 3、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围 4、学习高压蒸汽灭菌的操作方法 二、基本原理
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。其配方为：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，水 1000ml，pH 7.4~7.6。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源，而NaCl
提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。
任何一种培养基，一经制成就应及时彻底灭菌，以备培养微生物使用，一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌法。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能逸出，灭菌锅内的压力增加，使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
三、实验器材
牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂；1mol/L NaOH, 1mol/L HCl;
试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸
（pH5.5~9.0）培养基分装器，棉花，纱布，棉绳，牛皮纸，报纸，记号笔，试管架，剪刀等。
四、操作步骤
1、称量
按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。
2、溶化
在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀后在石棉网上加热溶解。将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，且不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足水分到所需的总体积。
3、调pH值
在未调前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如偏酸加适量NaOH,偏碱加适量HCl，直至达到要求。注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4、分装
按要求可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内。 5、加塞
在试管口或三角烧瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性。
6、包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸或二层报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。注明培养基名称、组别、配制日期。
7、灭菌
（1）加水：打开灭菌锅盖，取出内桶，再向外层锅内加入适量的水，使水位与三角搁架相平为宜。
（2）装入待灭菌物品：放回灭菌桶，并装入上述培养基，注意不要装得太紧，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。关闭灭菌锅盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋， 使蒸汽锅密闭，勿使漏气。
（3）排气：打开排气口（放气阀）。用电加热，待水煮沸后排除锅内的冷空气，当有大量蒸汽排出时，维持5分钟，使锅内冷空气完全排净，关上排气阀。
（4）升压、保压和降压：关闭排所阀后，锅内压力开始上升。当压力升到所需压力（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃20分钟）时，控制热源，维持压力到所需时间后，停止加热，待压力降至接近”0”时，打开排气阀排气。注意不能过急地排气，否则会由于锅内压力突然下降而造成锅内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，和使棉塞沾染培养基而发生污染。
（5）无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24~48小时，经检查无菌生长，可保存备用。
五、原始数据记录与数据处理
1、原始数据记录
记录本实验配制培养基的名称、配方及数量。
记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件（温度、压力等）。 2、数据处理
记录无菌检查结果。
六、思考题
1、培养微生物的培养基应具备哪些条件？为什么？ 2、在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？
3、培养基配制完后，为什么要及时灭菌？若不能及时灭菌，应如何处理？
4、高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快速降压？
实验五 微生物的无菌接种技术及培养特征
一、实验目的
1、学习掌握微生物的几种接种技术。 2、学习掌握倒平板的方法。
3、建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节。 4、了解不同的微生物在斜面上平板上的生长特征。 二、基本原理
将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定经及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠。影响下一步工作的进行。
微生物的培养特征是指微生物在固体、半固体和液体培养基中生长后所表现出的群体生长特征。不同的微生物有其固有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一，并能为识别纯培养是否被污染作为参考。了解它们的培养特征、掌握其生长规律对识别、控制和利用微生物具有重要价值。
固体培养基又分平板和斜面两种形式。在平板上主要观察菌落表面结构、形态及边缘状况（如P75图C）斜面上主要观察菌苔的形态。
三、实验器材
1、菌种和培养基
菌种：大肠杆菌和金黄葡萄球菌平板培养物
培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（已灭菌）
2、仪器或其他用具
酒精灯（芯）、火柴、标签纸、工业乙醇、无菌培养皿、接种环（针）、记号笔、
微波炉或加热装置（电炉、石棉网和升降台）、生化培养箱。
四、操作步骤 1、写标签（P10）
任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿(培养皿或试管)用记号笔做上记号，写上班级、姓名、日期、样品类别及来源，字尽量小些。写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。
注意：培养皿的记号一般写在皿底上。如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时容易混淆。
2、倒平板（P70）
将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基用微波炉或电炉加热融溶，混合均匀后分别倒平板，每位同学倒2皿。
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边用左手将试管赛或瓶赛轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰，然后用右手手撑边缘或小指夹住管（瓶）塞（若试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中）。左手拿培养