发布时间 : 星期三 文章SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子量更新完毕开始阅读
SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量
实验目的
了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术 学习SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术
实验原理
SDS-PAGE即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)：
1. 在混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷量。
2. 在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入适量SDS (阴离子表面活性剂)，使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上(一定条件下，大多数蛋白质与之结合比为1.4g SDS/1g protein)，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质之间原有的电荷差别。此时特定蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
3. 蛋白质分子量在15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值线性相关：若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可以获得一条标准曲线，而从未知蛋白质在相同电泳条件下的迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。
实验设备与试剂
垂直板型电泳槽 直流稳压电源 微量注射器
移液器 水浴锅 染色槽 烧杯 试管 滴管
分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl, pH8.8)：称取Tris 18.15g，加约80ml无离子水，用1 mol/L HCl调pH至8.8，无离子水定容至100ml，4℃保存
浓缩胶缓冲液(0.5 mol/L Tris-HCl液, pH6.8)：称取Tris 6g，加约60ml无离子水，用1 mol/L HCl调pH至6.8，无离子水定容至100ml，4℃保存
凝胶贮液：称取丙烯酰胺(Acr) 29.2g及N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis) 0.8g，重蒸水定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶于4℃保存
10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中并定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶于4℃保存
10%SDS溶液：10g SDS加重蒸水定容至100ml，室温保存(低温下易析出结晶，用前微热，使其完全溶解)
1%TEMED (四甲基二乙胺)
10%过硫酸铵(AP)：配制后分装，-20℃保存 电泳缓冲液(Tris-Gly缓冲液pH8.3)：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L
染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454ml 50%甲醇溶液和46ml冰乙酸即可
脱色液：75ml冰乙酸，875ml重蒸水与50ml甲醇混匀
实验步骤
1. 安装夹心式垂直板电泳槽：夹心式垂直板电泳槽有很多型号，主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。可根据具体不同型号要求进行操作。主要注意事项：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。
2. 配胶：根据待测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶和浓缩胶浓度，按下表配制： 试 剂 12%分离胶 3%浓缩胶 去离子水 ml 3.35 3.12 1.5 mol/L Tris-HCl ml 2.5 0.5 mol/L Tris-HCl ml 1.25 10% SDS ml 0.1 0.05 凝胶贮液 ml 4.0 0.6 10% AP ?l 50 25 1%TEMED ?l 5 5 3. 制备凝胶板： ①分离胶制备：
按表配制12%分离胶。由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液。混匀后用注射器抽取3.2~3.5ml凝胶液，加至长、短玻璃板间的缝隙内(立即清洗注射器及针头)。再用滴管取少许蒸馏水，沿长玻璃板壁缓慢注入约3~4mm高，以进行水封。30~60min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。
②浓缩胶的制备：
按表配制3%浓缩胶(待分离胶聚合后再加AP/TEMED)，混匀后用注射器加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处(立即清洗注射器及针头)。轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约30min后凝胶聚合。
待凝胶凝固后，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将Tris-Gly电泳缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。
4. 样品处理及加样
蛋白质标样及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5~1mg/ml，沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用(处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1min，以消除亚稳态聚合)。
一般加样体积为10~15?l。如样品较稀可适量增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部(双手操作，避免伤及凝胶)，待所有样品槽内都加完样品后即可开始电泳。
5. 电泳
将直流稳压电泳仪开关打开，将电流调至10~20mA (稳流)开始电泳。待蓝色染料(溴酚蓝)迁移至距凝胶底部约1cm时关闭电源。
6. 染色及脱色
取出玻璃板，先用注射器取水从两侧小心冲洗使之松动，再用取胶板轻轻将短玻璃板撬开移去(必要时同时用水冲洗)，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。
将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰。
7. 相对分子量计算
用直尺分别量取各蛋白质条带中心以及溴酚蓝条带中心距分离胶顶端的距离，按下式计算：
相对迁移率 = 样品迁移距离(cm) / 染料迁移距离(cm)
以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。
注意事项
1. 并非所有蛋白质都能用此法测定其分子量。已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的，包括电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1本身带有大量正电荷，尽管结合有正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响：其分子量是21,000，但用本法测定的结果却是35,000。因此有必要至少用两种方法来测定未知样品的分子量，以便互相验证。
2. 有许多蛋白质是由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(如?-胰凝乳蛋白酶)组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，本法测定的只是其亚基或单条肽链的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，以便与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。
思考题
1. 本法为何要用巯基乙醇？实验是否需要在低温下进行？ 2. 本实验误差的可能因素有哪些？试根据你的实验结果分析之