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分子生物学实验教案
实验1 质粒DNA小量提取和纯化
【时间安排】：3学时 【实验类型】：基本训练
【目的要求】：
1、 了解：质粒DNA的一般特征特性和提取质粒的原理； 2、 掌握：最常用的提取质粒DNA的方法；
3、 熟悉：质粒DNA小量提取和纯化的方法步骤。
【实验原理】：
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，在基因工程中具有及其广泛的应用价值，因此，质粒的分离、提取和纯化是最常用、最基本的实验技术。
质粒（plasmid）是一种独立、稳定的遗传因子，是在细菌等细胞中染色体之外的DNA分子，大小范围在1～200kb以上不等。大多数来自细菌细胞的质粒是双链、共价闭合的环状分子，以超螺旋形式存在。作为理想的克隆载体的质粒必须具备以下四点：（1）一个复制起点（raplication origin）；（2）一个或多个选择性标记基因，如抗生素基因；（3）带有一个人工合成的、含有多个限制性酶切位点的多克隆位点（Multiple cloning site, MCS）；（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。天然质粒存在不同程度的局限性，现在常用的质粒大多数都是经过修饰和改造过的质粒。
应用质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是获得批量纯化的质粒DNA分子。带有质粒的宿主（如大肠杆菌）细胞中，除了质粒外，还有基因组DNA和各种RNA的存在，并且还含有菌体组分的蛋白质、脂类物质等。提取质粒就是从这些混合物中将质粒分离出来。已经建立了多种从细菌中提纯质粒DNA的方法，这些方法无一例外都包括以下三个步骤：（1）培养细菌，使质粒大量扩增；（2）收集和裂解细菌并除去蛋白质和染色体DNA；（3）分离和纯化质粒。
本实验是采用SDS裂解法制备质粒DNA。人们使用碱与SDS裂解法从E.coli中分离制备质粒DNA已有20多年的历史。其原理是：
将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清液中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这是因为它们在拓扑学上是相互缠绕。只要OH处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，然后被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清液中回收复性的质粒DNA。
SDS裂解法制备质粒DNA通常使用Solution Ⅰ、Solution Ⅱ、Solution Ⅲ三种溶液，其生化作用原理：
Solution Ⅰ：溶菌液，葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解；EDTA螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制Dnase对DNA的降解作用（因为Dnase作用时，需要一定的金属离子作辅基）。
Solution Ⅱ：核酸在pH大于5，小于9的溶液中是稳定的，当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在Solution Ⅱ中NaOH的浓度为0.2mol/L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA和质粒DNA的变性；SDS是离子型表面活性剂，它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细
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胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3……R——蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
Solution Ⅲ：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH值至4.8必须加入大量的冰醋酸。所以Solution Ⅲ实际上是NaAc-HAc缓冲液。其作用是为了把pH12.6的抽提液中和，调pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol/L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电贺，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
【仪器与试剂】：
主要仪器：微量移液器、离心机、离心管、冰盒、恒温水浴锅、干燥器等。
主要试剂：LB培养基、抗生素、TE溶液、RNase溶液、NaAc溶液、酚/氯仿/异戊醇溶液、乙醇、缓冲液和溶液等
LB（Luria-Bertani）培养基：配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入细菌培养用胰化蛋白胨（bacto-tryptone）10g；细菌培养用酵母提取物（bacto-yeast extract）5g；NaCl 10g，充分溶解后用5mol/L NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1L，在15 lbf/in（1.034×105Pa）高压蒸汽灭菌20分钟。少量配制应按比例减小！ Solution Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0） Solution Ⅱ：200mmol/L NaOH，1%（m/v）SDS（要现用现配，室温使用！） Solution Ⅲ：3mol/L KAc（pH4.8）溶液。可这样配制：
5 mol/L乙酸钾 60.0ml 冰乙酸 11.5ml H2O 28.5ml
混合
（所配成的溶液中钾离子浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5 mol/L。保存于4℃，用时置于冰浴中。） 其他溶液：
酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），酚可用可不用！ NaAc：3mol/L
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【重要实验步骤和教学设计】：
1、 实验准备：制备含有相应抗生素的固体和液体LB培养基，将保存的菌液涂布到固体培
养基平板上培养单菌落（1～2天）。 2、 挑取单菌落在含有对应于某一抗生素(如Amp或Kan)的LB培养液（1.5mL）中接种，37℃振荡培养过夜，使细菌处于对数生长期（约12－16个小时）。 3、 吸取1.5mL培养液于eppendorf管中，12000rpm离心5分钟，弃去上清液，可用微量移液器适当吸取残余上清。细菌沉淀于管底。 4、 加入100μL溶液Ⅰ，用手指或涡旋振荡器剧烈弹震，使菌体充分悬浮，室温下静置5min。 5、 加入200μL新配制的溶液Ⅱ，盖紧管盖，上下温和颠倒eppendorf管2－3回，以混匀
内容物（千万不要剧烈振荡）,冰浴静置5min。 6、 加入150μL浴冷的溶液Ⅲ，上下颠倒混匀数次，冰浴条件下静置5min。 7、 12000rpm离心10min，将上清液移至新的eppendorf管中（约400μL）。 8、 加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分振荡混匀，12000rpm离心5min。
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9、 吸取上层水相至新的离心管中，加入十分之一体积量的3mol/L的pH5.2NaAc,再加入2倍体积（约1 mL）的预冷的无水乙醇。 10、 放入－20℃冰箱中静置30分钟，12000rpm离心15min。 11、 弃去上清，加入1mL预冷的70%乙醇，12000rpm离心5min，洗涤沉淀。 12、 弃去上清，沉淀在室温下自然干燥。然后加入40μLTE溶液。 13、 14、
取5μL的质粒与2μL的6X上样缓冲液混合后，在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳检测。 将所获得的质粒DNA样品置于4℃冰箱中备用。
【实验注意事项】：
1、 注意微量移液器、离心机的正确使用方法；
2、 在记入溶液Ⅱ时只需上下温和颠倒离心管即可，千万不能剧烈振荡。
3、 经抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的白色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。
【思考题】：
1、 作为理想的克隆载体的质粒必须具备哪些特点？ 2、 SDS裂解法制备质粒DNA的原理是什么？
3、 SDS裂解法制备质粒DNA中三种溶液的生化原理分别是什么？ 4、 除了SDS裂解法外，还有什么方法可以制备质粒DNA？
【实验后记】：
实验2 分光光度法测定DNA的浓度和纯度
【时间安排】：3学时 【实验类型】：基本训练 【目的要求】：
1、 了解：分光光度法测定DNA浓度和纯度的原理； 2、 掌握：分光光度法测定DNA浓度和纯度的技术方法；
3、 熟悉：分光光度法测定DNA浓度和纯度的实验操作步骤和注意事项。
【实验原理】：
前面提取得到的DNA的浓度和纯度都是未知的，在后续的DNA酶切、连接及转化等实验中需要一定的浓度和纯度要求，因此要测定DNA的浓度和纯度。
测定DNA的方法通常有：紫外分光光度法；琼脂糖凝胶电泳法（也叫荧光光度法） （1）紫外分光光度法：
组成DNA的碱基均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波长为250～270nm之间，腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鸟嘌呤：276nm，胸腺嘧啶：264.5nm，尿嘧啶：259nm。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不会改变，
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但核酸的最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm。这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线下，10OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；单链寡聚核苷酸为20μg/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。
分光光度法不但能够确定核酸的浓度，还可以通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。当然也会出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况，所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。
（2）琼脂糖凝胶电泳法（荧光光度法）：
对于很稀的核酸溶液，可以用琼脂糖凝胶电泳法。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，它插入到DNA分子中形成荧光结合物，使发射的荧光增强几十倍，而荧光的强度正比于DNA的含量，将已知浓度的标准样品作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。用量只需要5-10ng DNA即可，肉眼观察可检测0.05μg-0.1μg的DNA。该方法只是估计水平，另外还应考虑DNA或RNA样品中分子大小与标准对照中核酸分子的长度。
【仪器与试剂】：
主要仪器：紫外分光光度计、石英杯、离心管、微量移液器； 主要试剂：实验1提取的质粒样品、纯水。
【重要实验步骤和教学设计】：
1、 吸取5μL DNA样品或4μL RNA样品，加水至1ml混匀后，转入分光光度计的石英比色
杯中。如果样品很少，可以用0.5ml的比色杯，上述核酸样品与水的用量缩小一半。 2、 先用1ml水对分光光度计校正为零点。
3、 在260nm和280nm分别读出光密度，DNA样品的浓度我OD260 × 核酸稀释倍数 ×
50/1000；RNA样品的浓度OD260 × 核酸稀释倍数 × 40/1000；浓度单位为μg/μL。按
步骤1的稀释方式，DNA或RNA的浓度（μg/μL）均为OD260的10倍；如OD260为0.1，则样品的浓度就为1μg/μL DNA或RNA。这样稀释倍数非常便于计算。
4、 若为DNA样品，OD260/OD280比值大于1.8，说明仍存在RNA，可以考虑用RNA酶
处理样品；小于1.6，说明样品中存在蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，用乙醚抽提后，
以乙醇沉淀纯化DNA。RNA样品OD260/OD280比值小于2，也应该考虑再用酚/氯仿抽提。
【实验注意事项】：
1、 使用石英杯时要注意拿取方法，不要直接拿透光的那两个侧面； 2、 测量前要调零，测量不同样品时要冲洗石英杯； 3、 正确开、关紫外分光光度计。
【思考题】：
1、 实验得出的数据是否合理？为什么？
2、 如果实验测得A260/A280＝1.8，是否能说明提取的DNA样品非常纯净？为什么？
【实验后记】：
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