发布时间 : 星期三 文章02第二章 细胞生物学研究方法更新完毕开始阅读
1．镜筒，真空系统，电力系统 2．原生质体，相差显微镜
3．排阻层析，分子筛法，相对分子质量 4．倒置显微镜，相差显微镜
5．自发荧光，诱发荧光，诱发荧光 6．紫外光波长比可见光的波长短 7．突变，克隆化
8．溶菌酶，裂解酶，果胶酶或纤维素酶 9．病毒的外壳成分与细胞膜极为相似 10．环状光阑，带相板的物镜 11．物镜和照明系统的位置颠倒 12．0.1μm，0．1nm，3 nm
13．分辨出相邻两个点的，最小分辨距离 14．穿透性强，不需切片 15．酶反应，捕捉反应
16．离体条件下观察和研究生命活动的规律 17．Ca2+
18．单层生长，形态变成多态性，具有接触抑制现象 19．体外环境不能与体内的条件完全等同 20．柠檬酸铅，醋酸双氧铀 21．抗原
22．电磁，玻璃 23．重金属
24．显微结构，超微结构 25．线粒体，高尔基体，质膜 26．一半，最大值 27．3H-胸腺嘧啶核苷
28．可以产生抗体的淋巴细胞 29．冰冻蚀刻
30．脱去与DNA分子结合的水
31．氨基酸，维生素，无机盐，小牛血清 32．绿色，红色
33．相差显微镜，暗视野显微镜，倒置显微镜
34．100 μm，0．2 μm，0．1 nm，0．001 nm，3 nm，0.1μm
35．沉降速度，差速离心，密度梯度离心，差速，细胞器，快，慢，密度梯度，蔗糖，氯化铯，大小，电荷，滞留或吸附，电泳，性质(正与负)或多少，净电荷，大小和形状，电泳带谱.
二、判断题
1．正确。 2．正确。 3．正确。 4．正确。 5．正确。
6．错误。因密度不同而停留在不同的区带。
7．错误。通过染色是不行的。
8．错误。前者称为显微结构，后者称为亚显微结构或超微结构。 9．错误。光学显微镜可以，电子显微镜则不可以。
10．错误。亲和层析能分开特定的大分子是因为它们与特定的配体相互作用，而不是因为它们带有电荷。
11．正确。
12．错误。癌细胞由于失去了接触抑制，因而可成堆生长。 13．错误。主要是切得越薄，越易穿透。
14．错误，用Triton是不行的，Triton一般用来分离膜蛋白。 15．错误。淋巴细胞呈悬浮生长。 16．正确。
17．错误。尽管较大的细胞器在流体中移动时来自流体的摩擦力也较大，它经受的离心力也就越大，因此沉降得就越快。
三、选择题
l.B 11.A 21.B 31.B 41.C
2.B 12.A 22.C 32.C 42.C
3.D 13.ABC 23.A 33.C 43.C
4.D 14.D 24.D 34.A 44.B
5.A 15. C 25.D 35.C
6.C 16. D 26.B 36.B
7.A 17.C 27.C 37.C
8.A 18.B 28.B 38.A
9.A 19.A 29.D 39.B
10.B 20.D 30.D 40.C
四、简答题
1. 先将生物样品在液氮中迅速冷冻，防止形成冰晶，并迅速抽真空。在真空条件下，冰刀横切样品，使样品裂开暴露内表面结构，如细胞膜可沿脂双层分开形成两个半层膜。冰冻蚀 刻技术就是在此基础上发展起来的复形技术。将冰冻断裂后样品表面的冰升华，浮现出样品表面的超微结构，再对浮雕表面进行碳—铂复形，随后消化生物材料，只留下复形用作观察。
2．B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能无限分裂；而瘤细胞不能产生抗体，但能在体外无限传代。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，既能产生抗 体，又能无限增殖。
3．因为电镜样品的观察室要求高度的真空条件。 4．这两个概念都用于衡量显微镜的显微本领。放大率指显微镜所成像的大小与标本实际大小的比率。而分辨率指可视为明显实体的两个点间的最小距离。放大率对分辨率有影响，但分辨率不仅仅取决于放大率。两者都是观察亚细胞结构的必要参数。
5．都用于放大与分辨微小结构，这两种电镜通过标本对电子束的影响来探测标本结构。TEM (透射电镜)的电子束穿过标本，聚焦成像于屏幕或显像屏上，SEM(扫描电镜)的电子束在标本表面进行扫描，反射的电子聚焦成像于屏幕或显像屏。TEM用于研究超薄切片标本，有极高分辨率，可给出细微的胞内结构。SEM可以反映未切片标本的表面特征。 6．都是扩增和储存真核生物DNA片段的技术。·当克隆的DNA数目为几十到几百个碱基对时，细菌质粒是较合适的载体。对于较长的DNA分子，病毒载体更合适。在长满菌苔的 平板上可聚集成百上千的噬菌斑，每个都可以用于筛选目的基因。
7；两者都是依靠离心力对细胞匀浆悬浮物中的颗粒进行分离的技术。差速离心通常用于分离细胞器与较大的细胞碎片，分离的对象都比介质密度大。密度梯度离心也可用于分离较大的颗粒和细胞器，但更常用来分离小颗粒和大分子物质。密度梯度离心的介质形成一个密度梯度，所分离的颗粒密度小于介质底部的密度。因此颗粒从梯度的顶层沉降到与其密度相同的介质层并停留在此处。
8．这两种克隆可用于扩增和分离目的基因。基因组DNA包含了调控序列和间隔序列，而c-DNA克隆只含有编码序列。纯cDNA便于基因测序和蛋白质氨基酸序列的测定。基因组DNA克隆提供了有关DNA进化、基因家族和基因调控机制的信息。
五、实验设计与分析
1．根据不同的细胞器或分子具有不同的体积与密度，通过离心力场的作用加以分离。根据这两个主要因素可设计不同的离心分离方法：速度离心、等密度离心等。 2．(1)总匀浆物，上清1，沉淀2； (2)沉淀2； (3)总匀浆物； (4)上清3。
3．在通过凝胶层析柱时，小的分子移动较慢是由于小的分子在到达柱内装填的多孔小球时，在足够的时间内可扩散到凝胶孔隙内部，比大分子要经过更多的空间。如果流速很快，所有的分子都将快速地从小珠间隙中移动，而不进入内部，因此大分子和小分子倾向于一起从柱中流出。 4．测序结果如图A2-1所示。
5．(1)进行PCR反应后用限制性内切核酸酶处理，经过凝胶电泳，进行限制性长度多态性 检测； (2)用放射性标记糖类示踪，结合放射自显影；
(3)分离生长激素基因，重组并克隆，然后从表达该激素的转基因细胞中纯化该激素； (4)定点突变，然后进行酶促动力学分析。
6．其基本过程是先将细胞用研磨、超声振荡等物理方法破碎，使细胞悬浮液变成包含有细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网小泡等不同大小、形态的细胞器的匀浆液。再将匀浆液放入超迷离心机中离心，由于在密度均一的介质中，不同形态大小细胞器的沉降速度不同，颗粒越大的沉降越快而先到达离心管底。故以不同的离心速度分别离心一定时间，在不同离心力的作用下，细胞内的组分便会按从大到小的顺序分别沉降到离心管底而得以分离。
7．追踪活细胞中某种蛋白质合成与分泌的过程一般采用同位素示踪技术。其基本步骤是：
(1)将放射性同位素标记的氨基酸(如常用的3H_亮氨酸)加到细胞培养基中，在很短时间内使这些与未标记的相应氨基酸化学性质相同的标记分子进入细胞(称作脉冲标记)；
(2)除去培养液并洗涤细胞，再换以含未标记氨基酸的培养基培养细胞，已进入细胞的标 记氨基酸将被蛋白质合成系统作为原料加以利用，掺入到某种新合成的蛋白质中；
(3)每隔一定时间取出一定数量的细胞(取样)，利用电镜放射自显影技术探查被标记的特定蛋白质在不同时间所处的位置。具体说，将每次取样所得的细胞经固定、包埋后制备成细胞的超薄切片，放到有支持膜的载网上，涂上核乳胶，放到暗处曝光一段时间，即让细胞内带有放射性同位素的蛋白质发出的射线使乳胶感光。然后将核乳胶显影、定影便得到电镜显微放射自显影的标本。在电镜下
观察该标本中银粒的分布、相关蛋白质在细胞中的位置以及数量的多少。通过比较不同时间取样细胞的电镜照片就可了解细胞中蛋白质合成及分泌的动态过程。 8．从基因到蛋白质：
(1)基因组DNA分离目的基因；
(2)以基因组DNA克隆为探针筛选mRNA； (3)用目的基因的mRNA合成cDNA；
(4)对cDNA测序，根据其序列推导出蛋白质的氨基酸序列； (5)与其他功能已知的蛋白质进行氨基酸序列比较；
(6)构建含有该基因的质粒载体在大肠杆菌中进行基因表达，或采用其他表达载体， 从虽臼质到基因：
(1)根据其分子质量、等电点或功能分离蛋白质； (2)对蛋白质进行部分氨基酸测序；
(3)推导出编码蛋白质基因的部分核酸序列；
(4)合成—段放射标记的寡聚核苷链作为探针，在基因组DNA中进行筛选； (5)分离出完整的基因，测定包括调控区在内的基因序列。
六．问答题
1.原代培养是直接从机体中取得细胞或组织后立即进行的培养，严格的说是指成功继代之前的培养，此时细胞保持原有的基本性质。通常把第１代到第１０代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。原代培养物首次传代成功后即成为细胞系，由原先存在于培养细胞物中的细胞世系所组成。如果不能连续培养或继代次数有限，就称为有限细胞系，如可以连续培养则称为连续细胞系，培养至５０代以上并无限培养下去。细胞株是指从一个经过生物学鉴定的细胞系，由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群。所以细胞株是通过选择法或克隆形成从原代培养物或细胞系获得的，具有特殊性质或标记的培养细胞可培养至40－50代。
2．电子显微镜是以电子束为照明源，通过电子流对样品的透射或反射及电磁透镜的多级放大后在荧光屏上成像的大型仪器，而光学显微镜则是利用可见光照明，将微小物体形成放大影像的光学仪器。概括起来，电镜与光镜主要有以下几个方面的不同：
(1)照明源不同。电镜所用的照明源是电子枪发出的电子流，而光镜的照明源是可见光， 由于电子流的波长远短于光波波长，电镜的放大及分辨率显著高于光镜。 (2)透镜不同。电镜中起放大作用的物镜是电磁透镜，而光镜的物镜则是玻璃磨制而成的光学透镜。电镜中的电磁透镜共有三组，分别与光镜中聚光镜、物镜和目镜的功能。 (3)成像原理不同。在电镜中，作用于被检样品的电子束经电磁透镜放大后反映到荧光屏上成像或作用于感光胶片成像。其电子浓淡差别产生的机理是，电子束作用于被检样品时，入射电子与物质的原子发生碰撞产生散射，由于样品不同部位对电子有不同散射度。而光镜中样品的物像以亮度差呈现，它是由被检样品的不同结构吸收光线多少 (4)所用标本制备方式不同。电镜观察所用组织细胞标本的制备程序较复杂，技术难度和费用都较高，在取材、固定、脱水和包埋等环节上需要特殊的试剂和操作，还要制备超薄切片(50—100nm)。而光镜观察的标本则一般置于载玻片上，如普通组织切片标本、细胞涂片标本、组织压片标本和细胞滴片标本等。 3．扫描隧道显微镜(STM)是根据量子力学中的隧道效应发明的。利用扫描探针(直径为1埃)在样品表面扫描。当两者距离达到人数量级时，电子云发生重叠，外加微小电压(mV级)针尖与样品间就可因为隧道效应产生隧道电流，这种电流对于针尖与样品的间距 变化特别敏感。如果控制针尖与样品间距，以及保持隧道电流的稳定，那么探针在垂直样品方向上的高低变化，就可反映样品表面的起伏状态，获得样品表面的原子排列图像。STM适用于表面结构分析、表面电子态和化学特性分析。 优越性：
(1)高分辨率：原子级分辨率，横向为1埃，纵向为0．1埃；