发布时间 : 星期一 文章微生物学实验讲义 - 图文更新完毕开始阅读
微生物的接种技术是生物科学研究中的一项最基本的操作技术。由于目的不同，可采用不同的接种方法，如斜面接种、穿刺接种或三点接种等，以获得生长良好的纯种微生物。选择一种好的接种方法，对于微生物的分离、纯化、增殖和鉴别等都很重要。因接种方法的不同，常需采用不同的接种工具，如接种环、接种针、移液管和涂布棒等，它们的外形见图4－1。
为了确保纯种不被杂菌污染，在整个接种过程中，必须进行严格的无菌操作。 本实验就一些常规的微生物接种方法作一扼要介绍。
（三）实验材料 1. 菌种：
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；大肠杆菌（Escherichia coli）；黑曲霉（Aspergillus niger）等。
2. 培养基：
肉汤蛋白胨斜面4支，肉汤蛋白胨培养液2支（或装三角烧瓶），半固体肉汤蛋白胨直立柱4支，马铃薯葡萄糖琼脂平板6只（配方见附表二）。
3. 接种工具：
接种环、接种针、移液管、滴管、涂布棒。 4.其它：
标签纸、打火机、酒精灯（或煤气灯）、镊子、橡皮滴头等。
（四）实验步骤
1. 斜面接种：斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种把它移接到另一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下：
（1）贴标签：接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期等。标签纸要贴在斜面的正上方，距试管口约2～3厘米的位置。
（2）点酒精灯（或煤气灯）：注意火焰不要过大，以免气流运动过速。
（3）接种：用接种环将大肠杆菌移接到贴好标签的试管斜面上。无菌操作程序见图4－2，现简述如下：
手持试管：在左手的食指、中指和无名指间分别夹上菌种和待接斜面（斜面向上），并斜放使之近水平状态。
旋松棉塞：先用右手将棉塞旋松，以便拔出。
取接种环：右手拿接种环（如握钢笔一样），在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌。
拔棉塞：用右手的无名指、小指和手掌边先后拔出菌种管和待接试管的棉花塞（或试管帽），然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧得过烫）。
冷却接种环：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触菌种管的培养基（如斜面顶端）部分，使环冷却。
取菌种：待环冷却后轻轻沾取少量菌苔或孢子，然后将接种环移出菌种管。
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图附4－1 接种工具
1.接种针；2.接种环；3.接种铲；4.移液管；5.滴管；6－7.玻璃涂棒
图附4－2 斜面接种无菌操作程序
1.烧环；2.拔塞；3.移种；4.加塞；5.灭菌
接种：在火焰旁将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上作“Z”形来回密集划线。若要将菌体接入液体培养基中，则待接试管要适当向上倾斜。
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洗脱环上菌体时，要使环和容器壁摩擦几下以利洗下环上菌体，接种好后还要适当摇动以使菌体分散均匀。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
塞棉塞：接好种的试管口再次过火，并塞上棉花塞。
环灭菌：将接种环烧红灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。
（4）培养：将接过种的斜面放在37 ℃（细菌）或28 ℃（真菌和放线菌）恒温箱中培养。24小时后观察斜面生长结果。
2. 穿刺接种
经穿刺接种后的菌种常作为保藏菌种的一种形式，同时也是检查细菌运动能力的一种方法，它只适宜于细菌和酵母的接种培养。穿刺接种是一中用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体肉汤蛋白胨直立柱中的一种接种方法。具体操作如下：
（1）贴标签。 （2）点酒精灯。
（3）穿刺接种：穿刺接种方法见图4－3，操作要点说明如下： a手持试管。 b旋松棉塞。
c取接种针：右手拿接种针在火焰上将针端烧红灭菌。接着把在穿刺中可能伸入试管的其它部位，也过火灭菌。
d拔塞取菌：用右手的小指和手掌边拔出棉塞。接种针先在培养基部分冷却，再用接种针的针尖沾取少量菌种（蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌）。
e接种：将接种针自培养基的中心垂直地刺入培养基中。穿刺时要做到手
稳、动作轻巧快速，并且要将接种针穿刺到试管的底部，然后沿着原接种线将针拔出。最后，塞上棉塞，再将接种针上残留的菌在火焰上烧掉。
（4）培养：将接种过的试管直立于试管架上，放在37℃（细菌）或28℃（酵母菌）恒温箱中培养，24小时后观察结果。
（注意：若具有运动能力的细菌，它能沿着接种线向外运动而弥散，故形成的穿刺线较粗而散，反之则细而密）
3. 三点接种
要获得霉菌的单菌落，宜在平板上用三点接种法接种。即用接种针沾取少量霉菌孢子，在琼脂平板上点接成等边三角形的三点。经培养后，每皿形成三个菌落。其优点不但在一个培养皿上同种菌落有三个重复，更重要的是在菌落彼此相接近的边缘，常留有一条狭空白地带，此处菌丝生长疏稀，较透明，气生菌丝还分化出稀落的子实器官，因此可以直接把培养
图4－3 穿刺接种示意图
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皿放在低倍镜下观察子实体的形态特征，便于根据形态特点进行菌种的鉴定。这是单点接种法所难以做到的。
（1）倒平板：将已灭菌的马铃薯琼脂培养基放在水浴锅中充分加热融化，待冷却至45℃左右（手握不觉得太烫为宜）后，用无菌操作法倒平板，具体操作见图2－5（8）。
（2）贴标签：待平板凝固后，在培养皿底部贴上标签（也可用记号笔写），注明菌名、日期等。
（3）三点接种：用接种针从菌种斜面上分别挑取少量菌种孢子（产黄青霉、黑曲霉等），点接到对应的平板上。一般以三点（∴）的形式接种。操作要点为：
标明三点位置：欲使点接的三点分布均匀，可用记号笔先在平板底部以等边三角形状标上三点。
取接种针：拿接种针，先在火焰上烧红灭菌，并在平板培养基的边缘冷却且蘸湿。 沾取孢子：将灭过菌并蘸湿的接种针伸入菌种管，用针尖沾取少量霉菌孢子。
点接：将接种针上沾着的孢子以垂直的方向轻轻地点接平板培养基表面预先作好标记的部位。注意在点接时切勿刺破培养基。
(4) 培养：将点接好的平板倒置于28℃恒温箱中培养。48小时后开始观察生长情况。
4. 液体菌种接种技术
液体菌种接种技术是一种用移液管、滴管或接种环等将菌液移接到液体三角烧瓶、试管或固体培养基中的一种接种方法。具体操作如下：
（1）移液管的包装灭菌：移液管单支包装法可见图3－1，也可将它们放入铜质或玻璃筒内灭菌。
（2）取移液管：取用单支纸包装的移液管时，可将移液管打有纸结一端的包装纸拧断，露出移液管的末端，取出移液管。
（3）移菌液：用无菌操作吸取所需的菌液，移菌液操作见图4－5（3）所示。 （4）接种：
取待接培养液：左手拿待接种的三角烧瓶培养液（注意勿使瓶口朝天），并用右手的小指和手掌边拔出棉花塞或纱布通气塞，瓶口缓缓旋转过火。
接种：将移液管伸入三角瓶内，慢慢放出菌液至所需的接种量，或将菌液全部吹入三角瓶培养液中，塞上棉塞。在液体菌种中，经常采用倒种方法，即将菌液试管中的菌种倒入待接三角烧瓶培养液中。
（5）移液管灭菌：将用过的移液管投入5％石炭酸缸内灭菌。
（6）扎口：如使用通气塞，则还应将塞子拉好，用棉纱绳以活结形式将通气塞扎牢。 （7）培养：将接种过的三角烧瓶置于恒温箱内或摇床上恒温培养，24小时后观察生长结果。
图4－4 三点接种形成的青霉菌落
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