发布时间 : 星期二 文章微生物学实验讲义 - 图文更新完毕开始阅读
安全阀 温度计 压力表 放气阀 蒸汽入口 安全阀 排气口 压力表 安全阀 水位显示 排气口 排水口 图3－7 高压蒸汽灭菌锅结构
高压蒸汽灭菌器是一个能耐高压、同时可以密闭的金属锅，有立式、卧式、手提式三种（图3－7）。热源可以用蒸汽、煤气或电源。灭菌器上装有表示锅内温度和压力的温度计、压力表。灭菌锅还有排气口、安全活塞，如果压力超过一定限度，活塞的阀门便自动打开，放出过多的蒸汽。
高压蒸汽灭菌是把待灭菌物品放在一个密闭的高压蒸汽灭菌锅中，当锅内压力为0.1MPa时，温度可达到121℃，一般维持20 min即可杀死一切微生物的营养体及其孢子。高压蒸汽灭菌是依据水的沸点随水蒸汽压的增加而上升，加压是为了提高水蒸汽的温度。蒸汽压力与蒸汽温度关系及常用灭菌时间见表3－1
表3－1 高压蒸汽灭菌时常用的灭菌压力、温度与时间 蒸 汽 压 力*
Pa 56 70 100
kg/cm 0.56 0.70 1.00
2
蒸汽温度
b/in 8.00 10.00 15.00
2
灭菌时间(min)
(℃) 112.6 115.2 121.0
30 20 20
28
*1 kg/cm2(1千克/厘米2)≈105 Pa，1b/in2（1磅/寸2）≈6894.76 Pa，将几种单位列于同一表内以便于换算。
表3－2 空气排除程度与温度关系
压力表读数/Pa 35 70 105 140 175 210
高压蒸汽灭菌技术关键是在压力上升之前需将锅内冷空气排尽。若锅内未排除的冷空气滞留在锅中，压力表虽指121℃，但锅内温度实际上只有100℃（空气排除程度与温度关系见表3－2），结果造成灭菌不彻底。
待灭菌物品中的微生物种类、数量与灭菌效果直接相关。一般在小试管、锥形瓶中小容量的培养基，用121℃灭菌20min，大容量的固体培养基传热量慢，灭菌时间适当延长（灭菌时间是指达到所要求的温度开始计算）。天然培养基含菌和芽孢较多，较合成培养基灭菌时间略长。
灭菌时的过高温度常对培养基造成不良影响。如：
（1）出现浑浊、沉淀（天然培养基成分加热沉淀出大分子多肽聚合物；培养基中Ca、Mg、Fe、Zn、Cu、Sb等阳性离子与培养基中可溶性磷酸盐共热沉淀。）
（2）营养成分破坏或改变（酸度较高时淀粉、蔗糖、乳糖或琼脂灭菌过程易水解；pH7.5、121℃灭菌20 min，葡萄糖破坏20%，麦芽糖破坏50%，若培养基中磷酸盐共存，葡萄糖转变成酮糖类物质，培养液由淡黄色变为红褐色，破坏更为严重。
（3）pH7.2时培养基中的葡萄糖、蛋白胨、磷酸盐在121℃灭菌15 min以上可产生对微生物生长的某种抑制物。
(4) 高压蒸汽灭菌后培养基pH下降0.2～0.3。
(5) 高压蒸汽灭菌过程会增加冷凝水，降低培养基成分浓度。
对于前三种不良影响，可采用低压灭菌(如在112℃、30 min灭菌葡萄糖溶液)，或将培养基几种成分分别灭菌，临用前无菌混合（如磷酸盐与Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+等阳性离子溶液）的方法，特殊情况时可采用间歇灭菌、过滤除菌（如维生素溶液）。工业发酵生产中常采用连续加压灭菌法(135～140℃、5～15s)和连续蒸煮法。
灭菌前配培养基时适当调整。
（三）实验材料 手提式高压蒸汽灭菌锅。
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未排除空气
排除1/3空气
灭菌器内温度/℃
排除1/2空气
排除2/3空气
完全排除空气
72 90 100 109 115 121
90 100 109 115 121 126
94 105 112 118 124 128
100 109 115 121 126 130
109 115 121 126 130 135
待灭菌的培养基、无菌水、已包好的培养皿、移液管、玻璃涂棒等及待灭菌空试管、锥形瓶等玻璃器皿。
（四）实验步骤 1. 灭菌操作
1）打开灭菌锅盖向锅内加水，向锅内加适量水(立式高压蒸汽灭菌锅从进水杯处加煮开过的水到量高水位的标示高度)。水量不足，灭菌锅易蒸干。
2）放入待灭菌物品
将待灭菌物品放入灭菌桶内，物品不要放得太紧和紧靠锅壁，以免影响蒸汽流通和冷凝水顺壁流入灭菌物品。
3）盖好锅盖
将盖上的软管插入灭菌桶的槽内，有利于罐内冷空气自下而上排出，加盖，上下螺栓口对齐，采用对角方式均匀旋紧螺栓，使锅密闭。
4）排放锅内冷空气及升温灭菌
打开放汽阀，加热(电加热或煤气加热或直接通入蒸汽)，自锅内开始产生蒸汽后3 min再关紧放汽阀(或喷出气体不形成水雾)，此时蒸汽已将锅内的冷空气由排气孔排尽，温度随蒸汽压力增高而上升，待压力逐渐上升至所需温度时，控制热源，维持所需压力和温度，并开始计时，一般培养基控制在121℃灭菌20 min；含糖等成分培养基控制在112℃灭菌30 min或115℃灭菌20 min，关闭热源，停止加热，压力随之逐渐降低。
5）灭菌完毕降温及后处理
待压力降至0时，慢慢打开放汽阀(排汽口)，开盖，立即取出灭菌物品。但在压力未完全降至0处前，不能打开锅盖，以免培养基沸腾将棉塞冲出；也不可用冷水冲淋灭菌锅迫使温度迅速下降。所灭物品开盖后立即取出，以免凝结在锅盖和器壁上的水滴弄湿包装纸或落到被灭菌物品上，增加染菌率。斜面培养基自锅内取出后要趁热摆成斜面，灭菌后的空培养皿、试管、移液管等需烘干或晾干。若连续使用灭菌锅，每次需补足水分；灭菌完毕，除去锅内剩余水分，保持灭菌锅干燥。
2. 无菌试验
可抽少数灭过菌的培养基置37℃恒温箱中培养24h，若无菌生长，即视为灭菌彻底，可保存备用。
高灭蒸汽灭菌注意事项：
灭菌时人不能离开工作现场，控制热源维持灭菌时的压力。压力过高，不仅培养基的营养成分被破坏，而且高压锅超过耐压范围易发生爆炸造成伤人事故。
（五）实验报告内容
说明高压蒸汽灭菌原理、适用范围。用简练方法表示操作过程及操作关键。
（六）思考题
1. 高压蒸汽灭菌的关键为什么是高温而不是高压？高压蒸汽灭菌前为什么要将灭菌
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锅内的冷空气排尽？灭菌时为什么人不能离开工作现场？灭菌完毕后什么情况下才可以打开锅盖取灭菌物品？
2. 染菌或接种有微生物的培养基或培养器皿为什么不能直接洗涤而需先经过高压蒸汽灭菌？培养皿或锥形瓶内含菌固体培养基灭菌后如何处理？
3. 对含糖(如含葡萄糖或乳糖等)培养基进行高压蒸汽灭菌时，应采用多大压力、多长时间灭菌为宜？
4. 对血清、噬菌体浓缩液、氨基酸溶液、维生素溶液、抗生素溶液能否进行高压蒸汽灭菌？应采用何种方法除菌为宜？
实验四 微生物的分离与纯化
纯种分离技术是微生物学中重要的基本技术之一。从混杂微生物群体中获得单一菌株纯培养的方法称为分离。纯种(纯培养)是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。
为了生产和科研的需要，人们往往需从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其它微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组菌株。尽管所分离、纯化的菌种不同，但分离、筛选及纯化新菌种的步骤都基本相似。大致分为采样、富集培养、纯种分离和性能测定四个步骤。
采样：主要依据所筛选的微生物生态及分布概况，综合分析决定采样地点。
富集培养：根据所筛选菌种的生理特性，加入某些特定物质，使所需的微生物增殖，造成数量上的优势，限制不需要的微生物生长繁殖。对无特殊性能要求的菌，可省略此步。
纯种分离：可用10倍稀释平板分离法、涂布法、划线分离法、单细胞分离法等。 性能测定：可分初筛和复筛两步。
本章主要介绍细菌、放线菌、酵母菌、霉菌常见四大类微生物分离、纯化方法。 即使采用最现代的分离技术，人类生产和生活中现已开发利用的微生物尚未超过其存在量的1％。寻找和发现有重要应用潜力、具有新功能的微生物菌种资源，尚有待于不断提出新思路、新的筛选与分离方法的突破。
一、微生物的接种技术
（一）目的要求
了解无菌操作在微生物接种过程中的重要性。 掌握几种常用的微生物接种方法。
（二）基本原理
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