发布时间 : 星期三 文章微生物学实验讲义 - 图文更新完毕开始阅读
七、酵母菌的形态结构观察
（一）目的要求
观察并掌握酵母菌的菌落特征、个体形态、生长及繁殖方式。
（二）基本原理
酵母菌细胞的个体形态、繁殖方式及菌落特征。
在光学显微镜下，大多数酵母菌为单细胞，一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬形。大小约为1～5×5～30μm、，最大可达100μm。各种酵母菌有其一定的大小和形态，但也随菌龄和环境条件而异；即使在纯培养中，各个细胞的形状、大小亦有差别。有些酵母菌细胞与其子代细胞连在一起成为链状，成为假丝酵母。大多数酵母在平板培养基上形成的菌落较大而厚，湿润、较光滑，颜色较单调（多为乳白色，少有红色，偶见黑色）。酵母细胞核与细胞质有明显的分化，个体直径比细菌大几倍到十几倍。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，有些酵母能形成假菌丝。有性繁殖是通过接合形成子囊及子囊孢子。
观察酵母菌个体形态时，应注意其细胞形状；无性繁殖是芽殖或裂殖，芽体在母体细胞上的位置，有无假菌丝等特征；有性繁殖形成的子囊和子囊孢子的形状及数目。
（三）实验材料 1．菌种 酿酒酵母。 2．染液及溶液
7.6%孔雀绿染液，0.5%蕃红染液。 3．其它物品 载玻片及盖玻片等。 （四）实验内容
个体形态特征与出芽繁殖的观察： 酵母细胞较大，用水浸片法观察，即在载玻片中央滴加一小滴无菌水或滴加0.1%美蓝液一小滴，无菌操作用接种环取酿酒酵母少许（并注意酵母菌与培养基结合是否紧密），置于无菌水或美蓝液中，使菌体与其混合均匀。将盖玻片
斜置轻轻盖在液滴上。制片先用低倍镜，再换高倍镜观察酵母细胞的形状及出芽方式。
（五）实验报告内容
绘图：酿酒酵母的菌体、出芽方式。
（六）思考题
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图1－5 酵母菌形态结构（箭头示出芽细胞）
1. 酵母菌和细菌细胞在形态、结构上有何区别？
2. 在同一平板培养基上若同时有细菌及酵母菌两种菌落，如何识别。 3. 细菌、放线菌、霉菌及酵母菌菌落特征如何识别？个体形态有何差别？
实验二 微生物显微计数及活菌观察
一、血球计数板的使用及酵母菌的显微计数（暗视野）
（一） 实验目的 学习血球计数板的使用。
直接计数法测定样品中酵母细胞数。
（二）实验原理
利用血球计数器在显微镜下直接计数是一种常见的微生物计总数的方法。因为计数器载片和盖片间的容积一定，所以可以根据显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内微生物总数。
图2－1 两种血球计数板
血球计数器是一只特制载玻片。载片上有两个方格网，每一方格网共分九个大方格，其中间的一个大方格用来做微生物计数，所以又称为计数室。计数室的刻度一般有两种，一种是每个大方格分成16个中方格，每中方格又分成25个小方格（麦氏血细胞计数板）。另一种是一个大方格分25个中方格，每个中方格又分成16个小方格（希里格血细胞计数板。但
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是不论哪一种，一个大方格，都等分成（25×16或16×25）400个小方格。（图2－1）因为每个大方格边长为1毫米，载片与盖片间距离为0.1毫米，所以每个计数室（1个大方格）体积为0.1立方毫米。测出每个中方格菌数，就可以算出一个大方格的菌数，由此推算出1毫升菌液内所含的菌数。
（三）实验材料 1. 器材
血球计数板、计数器、显微镜。 2. 菌种 酿酒酵母菌液。
（四）操作步骤 1. 血球计数板的操作
1） 取一个清洁的血球计数板，将洁净的专用盖玻片放置在计数室上；
2） 把在液体培养基上室温培养了24～48h的酿酒酵母菌悬液进行稀释，以每小格有
3～5个酵母菌为宜；
3） 摇匀稀释的酵母菌液，用无菌滴管吸取少许菌液，沿盖玻片的边缘滴一小滴（不宜
太多），使菌液自行渗入计数室（两个计数室各滴一滴；注意：加菌液时不得使计数室内有气泡），静置5 min；
4） 将计数板放置在显微镜的载物台上，先在低倍镜下找到方格网，然后转到高倍镜下
进行观察和计数。 2. 计数方法
1） 不同规格的计数板的计数方法略有差异，一个大方格是16个中方格的（16×25），
应当数4角4个中方格（即100个小方格）的菌数；一个大方格是25个中方格的（25×16），除取4角4个中方格外，还要数中央一个中方格（即为80个小方格）的菌数。注意：酵母菌的芽体达到母体细胞大小的一半者，即可作为两个菌体计数；位于两个中方格间线上的酵母菌，只统计此格的上侧和右侧线上的菌体数，即数上不数下，数左不数右；
2） 每个样品重复计数2～3次（每次计数结果不应相差太大，否则重新操作），求平
均值；
3） 按下列公式计算出每毫升菌液所含的酵母菌细胞数； 16×25计数板：
总菌数/ml?100个小方格内菌数100?400?10000?稀释倍数
＝每个小方格内菌数×4×106×稀释倍数
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25×16计数板：
总菌数/ml?80个小方格内菌数80?400?10000?稀释倍数
＝每小方格内菌数×4×106×稀释倍数
（五）实验报告内容
记录计数结果并计算出每毫升菌液中的酵母菌细胞数。
（六）思考题
1.在滴加菌液时，为什么要先盖上盖玻片后再滴加菌液？能否先滴加菌液再盖盖玻片？ 2.用血球计数板测定微生物数量时，哪些步骤易造成误差？如何预防？ 3.计数细菌数目时此法是否适用？
二、大肠杆菌活菌的运动观察
（一）实验目的
学习了解在暗视野中观察细菌的运动。
（二）实验原理
鞭毛（flagellum，复flagella）是生长在某些细菌体表的长丝状、波曲的蛋白质附属物，其数目为—至数十条，具有运动功能。鞭毛的长度一般为15～20μm，直径为0.01l～0.02μm。观察鞭毛最直接的方法是用电子显微镜，用特殊的鞭毛染色法使染料沉积在鞭毛上，加粗后的鞭毛也可用光学显微镜观察。在暗视野中，对水浸片或悬滴标本中运动着的细菌，也可根据其运动方式判断它们是否具有鞭毛。在下述两种情况下，单凭肉眼观察也可初步推断某细菌是否存在着鞭毛：①在半固体(含0.3％～0.4％琼脂)直立柱中用穿刺法接种某一细菌，经培养后，若在穿刺线周围有呈混蚀的扩散区，说明该菌具有运动能力，并可推测其长有鞭毛，反之，则无鞭毛；②根据某菌在平板培养基上的菌落外形也可推断它有无鞭毛，一般地说，如果该菌长出的菌落形状大、薄且不规则，边缘极不圆整，说明该菌运动能力很强，反之，若菌落外形圆整、边缘光滑、厚度较大，则说明它是无鞭毛的细菌。
原核微生物(包括古生菌)鞭毛的构造由基体、钩形鞘和鞭毛丝三部分组成。革兰氏阳性细菌和阴性细菌在基体的构造上稍有区别。革兰氏阴性细菌的鞭毛最为典型，现以大肠杆菌的鞭毛为例。它的基体(basal body)由四个盘状物即环(ring)组成，最外层的L环连在细胞壁最外层的外膜上，接着是连在肽聚糖内壁层的P环，第三个是靠近周质空间的S环，它与第四个环即M环连在一起称S－M环或内环，共同嵌埋在细胞质膜上。S－M环被一对Mot蛋白包围，由它驱动S—M环快速旋转。在S—M环的基部还存在一个Fli蛋白，起着键钮的作用，它可根据细胞提供的信号令鞭毛进行正转或逆转。目前已清楚地知道，鞭毛基体实为精致、超微型的马达，其能量来自细胞膜上的质子动势(proton motive potential)。据计算，
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