微生物学实验讲义 - 图文

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1)连续划线法

以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。将菌种点种在平板边缘一处,取出接种环,烧去多余菌体。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板,在平板边缘空白处接触一下使接种环冷凉,然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线,划线时平板面与接种环面成30~40°。以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,接种环不要嵌入培养基内划破培养基,线条要平行密集,充分利用平板表面积,注意勿使前后两条线重迭(图4-8A,4-9)。划线完毕,关上皿盖。灼烧接种环,待冷凉后放置接种架上。培养皿倒置于适温的恒温箱内培养(以免培养过程皿盖冷凝水滴下,冲散已分离的菌落)。培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态,涂片镜检为纯种后再接种斜面。

图4-9 划线分离接种示意图

2)分区划线法(四分区划线法,图4-8B)

取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。分区划线法划线分离时平板分4个区,故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区,故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触,应使4区线条与1区线条相平行,这样区与区间线条夹角最好保持120°左右。先将接种环蘸取少量菌在平板1区划3~5条平行线,取出接种环,左手关上皿盖,将平板转动60~70°,右手把接种环上多余菌体烧死,将烧红的接种环在平板边缘冷却,再按以上方法以1区划线的菌体为菌源,由1区向2区作第2次平行划线。第2次划线完毕,同时再把平皿转动约60~70°同样依次在3、4区划线。划线完毕,灼烧接种环,关上皿盖,同上法培养,在划线区观察单菌落。

本次实验在分离细菌的平板上选取单菌落,于肉膏蛋白胨平板上再次划线分离,使菌进一步纯化。划线接种后的平板,倒置于30℃恒温箱中培养24h后观察结果。

3. 微生物菌落计数(平板菌落计数法)

含菌样品的微生物经稀释分离培养后,每一个活菌细胞可以在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落。故可根据平板上菌落的数目,推算出每克含菌样品中所含的活菌总数。

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每克样品中微生物的活细胞数=同一稀释度3个平板上菌落平均数含菌样品克数?稀释倍数

一般由三个稀释度计算出的每克含菌样品中的总活菌数和同一稀释度出现的总活菌数均应很接近,不同稀释度平板上出现的菌落数应呈规律性地减少。如相差较大,表示操作不精确。通常以第二个稀释度的平板上出现50个左右菌落为好。也可用菌落计数器计数。

4. 平板菌落形态及个体形态观察

从不同平板上选择不同类型菌落用肉眼观察,区分细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落形态特征。并用接种环挑菌,视其与基质结合紧密程度。再用接种环挑取不同菌落制片,在显微镜下进行个体形态观察。将所分离的含菌样品中明显不同的各类菌株的主要菌落特征和细胞形态记录于表2-4。

5. 分离纯化菌株转接斜面(斜面接种)

在分离细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的不同平板上选择分离效果较好,认为已经纯化的菌落各挑选一个用接种环接种斜面。将细菌接种于肉膏蛋白胨斜面,放线菌接种于高氏1号斜面,酵母菌和霉菌接种于豆芽汁葡萄糖斜面上。

贴好标签,在各自适宜的温度下培养,培养后观察是否为纯种,记录斜面培养条件及菌苔特征于表2-5。置冰箱保藏。

(五)实验报告内容

1. 简述分离微生物纯种的原则及列出分离操作过程的关键无菌操作技术。 2. 记录微生物四大类菌的分离方法及培养条件于表4-2。

表4-2 微生物四大类菌的分离方法及培养条件 分离对象 细 菌 放线菌 霉 菌 酵母菌 样品来源 土 壤 土 壤 土 壤 果园土或面肥 分离方法 稀释度 培养基 培养温度 培养时间 3. 将你所分离的微生物平板菌落计数结果填入表4-3中。

表4-3 平均每克样品所含微生物数 皿 第1皿 第2皿 第3皿

每皿长出菌落数 10- 10- 45

每克样品所含菌数 10- 10- 10- 10-

均值 4. 将你所分离样品中单菌落菌株的菌落培养特征与镜检形态记录于表4-4。 表4-4 含菌样品中分离的菌株特征记录 分离日期 地点 菌株编号 分离培养基 菌落特征 镜检形态 5. 记录斜面培养条件及菌苔特征(包括纯化结果)于表4-5。

表4-5 微生物四大类菌的斜面培养条件及菌苔特征

微生物 细 菌 放线菌 酵母菌 霉 菌 6. 请设计分离筛选下列微生物菌种的试验方案(任选一种)。

提示:包括采样、稀释液制备、培养基名称、培养温度、培养时间、分离纯化方法等。 (1) 酸奶中乳酸菌的分离、纯化。 (2) 土壤中链霉素产生菌的分离、纯化。

(3) 啤酒泥或酒曲发酵窖泥中酵母菌分离、纯化。 (4) 甜酒药曲或酿酒种曲中霉菌的分离、纯化。

(六)思考题

1. 稀释分离时,为什么要将已融化的琼脂培养基冷却到45~50℃左右才能倾入到装有菌液的培养皿内?

2. 划线分离时为什么每次都要将接种环上多余菌体烧掉?划线时为何不能重迭? 3. 在恒温箱中培养微生物时为何培养皿均需倒置?

4. 分离某类微生物时培养皿中出现其它类微生物,请说明原因?应该如何进一步分离和纯化?经过一次分离的菌种是否皆为纯种?若不纯,应采用哪种分离方法最合适? 5. 根据哪些菌落特征可区分细菌、放线菌、酵母菌与霉菌?它们的细胞结构表现在菌落形态上有什么联系?

培养基名称 培养温度 养培时间 菌苔特征 纯化程度 实验五 环境因素对微生物生长的影响

(一)目的要求

了解某些物理因素、化学因素和生物因素对微生物生长的影响及芽孢对不良环境的抵抗能力。

(二)基本原理

环境因素(包括物理因素、化学因素和生物因素),如温度、渗透压、紫外线、pH、氧气、

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某些化学药品及拮抗菌等对微生物的生长繁殖、生理生化过程产生影响。不良的环境条件使微生物的生长受到抑制,甚至导致菌体的死亡。但是某些微生物产生的芽孢,对恶劣的环境条件有较强的抵抗能力。我们可以通过控制环境条件,使有害微生物的生长繁殖受到抑制,甚至被杀死;而使有益微生物得到发展。

(三)实验材料 1. 菌种

金黄色葡萄球菌。 2. 培养基

肉膏蛋白胨培养基。 3. 其它物品

培养皿、无菌圆滤纸片、镊子、无菌水、无菌滴管、水浴锅、紫外线灯、黑纸。 4. 药品

青霉素、来苏儿水、新洁尔灭、甲醛、乙醇。

(四)实验步骤

1. 物理因素对微生物生长的影响

紫外线主要作用于细胞内的DNA,使同一条链DNA相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体,引起双链结构扭曲变形,阻碍碱基正常配对,从而抑制DNA的复制,轻则使微生物发生突变;重则造成微生物死亡。紫外线照射的剂量与所用紫外光灯的功率(瓦数)、照射距离和照射时间有关。当紫外光灯和照射距离固定,照射的时间越长则照射的剂量越高。紫外线透过物质的能力弱,一层黑纸足以挡住紫外线的通过。本实验是验证紫外线的杀菌作用及不同微生物对紫外线的抵抗能力。

(1) 取肉膏蛋白胨培养基平板3个,分别标明大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球等实验菌的名称。

(2) 分别用无菌移液管取培养18~20h的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌菌液0.1ml(或2滴),加在相应的平板上,再用无菌涂棒涂布均匀,然后用无菌黑纸遮盖部分平板。

(3) 紫外灯预热10~15 min后,把盖有黑纸的平板置紫外灯下,打开培养皿盖,紫外线照射20 min(照射的剂量以平板没有被黑纸遮盖的部位,有少量菌落出现为宜),取去黑纸,盖上皿盖。

(4) 37℃培养24h后观察结果,比较并记录三种菌对紫外线的抵抗能力。

2. 不同药物的杀菌实验

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图7-18 紫外线照射对微生物生长的影响

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