发布时间 : 星期一 文章微生物学实验讲义 - 图文更新完毕开始阅读
图4－４ 斜面接种后生长的菌苔类型
（五）实验报告内容
1. 检查你的斜面接种情况，绘制斜面生长草图，并说明是属于下列哪一类。 2. 分析你的斜面接种好坏的原因。
3. 检查你的穿刺接种结果，并绘制结果草图。 4. 分析穿刺接种好坏的原因。
5. 检查三点接种生长情况，描述每一菌种的菌落特征。
（六）思考题
1. 接种时，为什么要严格地按照无菌操作程序进行。 2. 斜面接种时，标签要贴在斜面的什么位置，为什么？ 3. 穿刺接种时应注意什么？
4. 三点接种时为什么不要刺破培养基。
二、土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化
（一）目的要求
学习、掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离等技术。 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。
学习平板菌落计数法。
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（二）基本原理
土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌；自面肥或酒曲或果园土分离酵母菌。
为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。各类菌稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性；避免菌源中各类微生物的相互干扰。细菌或放线菌皆喜中性或微碱性环境，但细菌比放线菌生长快，分离放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加l0％的酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌(如加链霉素25～50u/m1以抑制细菌；添加制霉菌素50u /m1或多菌灵30u／m1以抑制霉菌)。酵母菌和霉菌都喜酸性环境，一般酵母菌只能以糖为碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH 5时生长极快，而细菌生长适宜的酸碱度为pH7，所以分离酵母菌时，只要选择好适宜的培养基和pH，可降低细菌增殖率。霉菌生长慢，也不干扰酵母菌分离。若分离霉菌，需降低细菌增殖率，一般培养基临用前需添加灭过菌的乳酸或链霉素。为了防止菌丝蔓延干扰菌落计数，分离霉菌时常在培养基中加入化学抑制剂。要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表4－l所示。
（三）实验材料
1. 菌源：选定采土地点后，铲去表土层2～3cm，取3～10cm深层土壤10g，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。
表4－1 微生物四大类菌的分离和培养 样品来源 土样 土样 土样 面肥(或土样) 细菌分离平板 分离对象 细菌 放线菌 霉菌 酵母菌 细菌 分离方法 稀释分离 稀释分离 稀释分离 稀释分离 划线分离 稀释度 10－5～10－7 10－3～10－5 10－2～10－4 10－4～10－6 培养基名称 肉膏蛋白胨 高氏合成1号 马铃薯 豆芽汁葡萄糖 肉膏蛋白胨 培养温度℃ 30～37 28 28～30 30～37 28～30 时间／d 1～2 5～7 3～5 1～2 2～3
2. 培养基
肉膏蛋白胨培养基、高氏合成l号培养基、马铃薯培养基、豆芽汁葡萄糖培养基(制平板和斜面)。配方见附录二。
3. 无菌水或无菌生理盐水
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配制生理盐水，分装于250 m1锥形瓶，每瓶装99 ml(或95 m1为分离霉菌用)，每瓶内装10粒玻璃珠。分装试管、每管装9 m1(每人5～7支)。
4. 其它物品
无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒(刮刀)、称量纸、药勺、橡皮头、10％酚溶液。
（四）实验步骤 1. 稀释分离法
平板分离菌有倾注法和涂布法两种。本次实验分离细菌、放线菌、霉菌时采用倾注法，酵母菌分离采用涂布法。
1）细菌的分离
制备土壤稀释液：称取土样1g，在火焰旁加入到一个盛有99 m1无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中，振荡10～20 min，使土样中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成10－2稀释度的土壤稀释液。
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按10倍稀释法进行稀释分离，以制备10－7稀释度为例，具体操作过程如下：取9 ml
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