发布时间 : 星期一 文章微生物学实验讲义 - 图文更新完毕开始阅读
目 录
实验一 微生物制片及形态观察 ...............................................................................1
一、显微镜油镜的使用 ........................................................................................ 1 二、细菌简单染色法及形态观察 ........................................................................ 3 三、革兰氏染色法 ................................................................................................ 6 四、细菌的芽孢染色 ............................................................................................ 8 五、放线菌的形态结构观察 .............................................................................. 10 六、霉菌的形态结构观察 .................................................................................. 11 七、酵母菌的形态结构观察 .............................................................................. 12 实验二 微生物显微计数及活菌观察 .................................................................... 13
一、血球计数板的使用及酵母菌的显薇计数（暗视野） .............................. 13 二、大肠杆菌活菌的运动观察 .......................................................................... 15 三、放线菌及霉菌的水悬液观察 ...................................................................... 17 实验三 培养基的配制及灭菌 ................................................................................ 18
一、培养基的常规配制程序 .............................................................................. 19 二、细菌、放线菌常用培养基的配制 .............................................................. 24 三、酵母菌、霉菌常用培养基的配制 .............................................................. 26 四、高压蒸汽灭菌 .............................................................................................. 27 实验四 微生物的分离与纯化 ................................................................................ 31
一、微生物的接种技术 ...................................................................................... 31 二、土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化 .............................. 36 实验五 环境因素对微生物生长的影响 ................................................................. 46 实验六 微生物深层培养生产α-淀粉酶及其酶活测定......................................... 48 实验七 链霉素发酵及管碟法测定生物效价微生物发酵 .................................... 51 实验八 硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌产生α-淀粉酶的诱变效应......................... 56 附 15升发酵罐操作示范 ........................................................ 错误！未定义书签。
实验一 微生物制片及形态观察
一、显微镜油镜的使用
显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。
1. 结构
光学显微镜是由光学放大系统和机械装置两部分组成。光学系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等；机械系统一般包括镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和底座等（图1－1）。
图1－1 光学显微镜结构图
标本的放大主要由物镜完成，物镜放大倍数越大，它的焦距越短。焦距越小，物镜的透镜和玻片间距离（工作距离）也小。油镜的工作距离很短，使用时需格外注意。目镜只起放大作用，不能提高分辨率，标准目镜的放大倍数是十倍。聚光镜能使光线照射标本后进入物镜，形成一个大角度的锥形光柱，因而对提高物镜分辨率是很重要的。聚光镜可以上下移动，以调节光的明暗，可变光栏可以调节入射光束的大小。
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显微镜用光源，自然光和灯光都可以，以灯光较好，因光色和强度都容易控制。一般的显微镜可用普通的灯光，质量高的显微镜要用显微镜灯，才能充分发挥其性能。有些需要很强照明，如暗视野照明、摄影等，常常使用卤素灯作为光源。
2. 原理
显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。
3. 使用方法 1）低倍镜观察
先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。除少数显微镜外，聚光镜的位置都要放在最高点。如果视野中出现外界物体的图像，可以将聚光镜稍微下降，图像就可以消失。聚光镜下的虹彩光圈（即可变光栏）应调到适当的大小，以控制射入光线的量，增加明暗差。
2）高倍镜观察
显微镜的设计一般是共焦点的，低倍镜对准焦点后，转换到高倍镜基本上也对准焦点，只要稍微转动微调即可。转换物镜后，要同时调节虹彩光圈的大小，使之与所使用物镜放大倍数相同的刻度。稍微上下移动聚光镜，观察图像是否清晰。
3）油浸镜观察
油浸镜的工作距离很小，所以要防止载皮片和物镜上的透镜损坏。使用时，一般是经低倍、高倍到油浸镜。当高倍物镜对准标本后，再加油浸镜观察。载玻片标本也可以不经过低倍和高倍物镜，直接用油浸镜观察。显微镜有自动止降装置的，载玻片上加油以后，将油浸镜下移到油滴中，到停止下降为止，然后用微调向上调准焦点。没有自动止降装置的，对准焦点的方法是从显微镜的侧面观察，将油浸镜下移到与载玻片稍微接触为止，然后用微调向上提升调准焦点。
使用油浸镜时，镜台要保持水平，防止油流动。油浸镜所用的油要洁净，聚光镜要提高到最高点，并放大聚光镜下的虹彩光圈，否则会降低数值口径而影响分辨率。无论是油浸镜或高倍镜观察，都宜用可调节的显微镜灯作光源。
4. 注意事项
显微镜是精密贵重的仪器，必须很好地保养。显微镜用完后要放回原来的镜箱或镜柜中，同时要注意下列事项：
1）观察完后，移去观察的载玻片标本。
2）用过油浸镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。 3）转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。
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4）将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。 镜头的保护最为重要。镜头要保持清洁，只能用软而没有短绒毛的擦镜纸擦拭。擦镜纸要放在纸盒中，以防沾染灰尘。切勿用手绢或纱布等擦镜头。物镜在必要时可以用溶剂清洗，但要注意防止溶解固定透镜的胶固剂。根据不同的胶固剂，可选用不同的溶剂，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。方法是用脱脂棉花团蘸取少量的二甲苯，轻擦，并立即用擦镜纸将二甲苯擦去，然后用洗耳球吹去可能残留的短绒。目镜是否清洁可以在显微镜下检视。转动目镜，如果视野中可以看到污点随着转动，则说明目镜已沾有污物，可用擦镜纸擦拭接目的透镜。如果还不能除去，再擦拭下面的透镜，擦过后用洗耳球将短绒吹去。在擦拭目镜或由于其他原因需要取下目镜时，都要用擦镜纸将镜筒的口盖好，以防灰尘进入镜筒内，落在镜筒下面的物镜上。
二、细菌简单染色法及形态观察
运用普通光学显微镜来进行微生物形态学特征的观察是实验室常用方法，然而，微生物（尤其是细菌）细胞小而透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜观察细菌时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于着色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及某些细胞结构，因此，为了研究微生物的形态特征和鉴别不同类群的微生物，微生物的染色及形态结构的观察是微生物学实验中十分重要的基本技术。
用于微生物染色的染料，是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。发色基团赋予化合物的颜色特征，助色基团则给予化合物能够形成盐的性质，仅含发色基团的苯化合物（称色原）即使带有颜色也不能作为染料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，对微生物（或其他材料）没有结合力，很容易被洗脱或机械方法除去。染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类。在微生物染色中，碱性染料较常用，如常用的美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、蕃红（即沙黄）、孔雀绿等都属碱性染料。
这部分实验着重于细菌的染色观察，同时也进行放线菌、酵母菌和丝状真菌的形态学观察。其目的是使同学在掌握细菌染色观察技术的基础上，了解其他微生物形态结构的观察方法；初步认识各类微生物的形态特征，巩固课堂知识，增强感性认识。
（一）目的要求
学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。 初步认识细菌的形态特征。
巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。
（二）基本原理
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌丝体一般形状和细菌排列的观察。
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