发布时间 : 星期四 文章生物化学-酵母提取更新完毕开始阅读
综合实验 酵母RNA的提纯及其定性鉴定与定量测定
一、实验目的
1、学习RNA提取的几种常用方法并掌握浓盐法提取RNA的原理和方法。 3、掌握几种定性鉴定所得RNA的原理与方法。 4、掌握两种定量测定所得RNA的原理和方法。
5、学习电泳技术的基本原理及其分类以及相关的应用。 Ⅰ 提纯部分
? 浓盐法提取酵母RNA ? Ⅱ 定性鉴定部分 一、RNA基团鉴定 二、电泳分离鉴定 三、光谱鉴定 四、纯度鉴定
Ⅲ 定量测定部分
? 一、地衣酚法定量测定 ? 二、紫外吸收法定量测定
生物大分子物质提取的基本原理与步骤
一、材料选择与处理 二、细胞破碎 三、细胞器分离 四、提取 五、纯化
六、浓缩、干燥 七、样品保存 八、定性鉴定 九、定量测定 10、物质的利用 核酸的分布
? DNA：细胞核（95%） 细胞器（5%） RNA：细胞质（75%) 细胞核(10%) 细胞器(15%)
? RNA以rRNA的数量最多（80％-85%)
核酸提取的主要步骤
? 破碎细胞
? 去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子 ? 去除其它不需要的核酸分子
? 沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质
核酸分离纯化原则
? 保证核酸一级结构的完整性 ? 排除其它分子的污染
? 简化操作，缩短时间，以减少各种有害因素对核酸的破坏 ? 减少化学因素对核酸的降解(pH4-10)
? 减少物理因素对核酸的降解(机械剪切力 、 高温) ? 防止核酸的生物降解(DNA酶 、 RNA酶) 实验原理 ? 由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性。 ? 酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体的
2.67%-10.0%，而DNA含量较少，仅为0.03%-0.516%。为此提取RNA多以酵母为原料。工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。
? 稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。
? 浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。 RNA提取方法方法与分类 ? 稀碱法( 0.2% NaOH ) ? 浓盐法( 10% NaCl ) ? 苯酚法
? 氯仿-异戊醇法 ? 去污剂法 ? 盐酸胍法
三、试剂和器材
1、试剂
（1）干酵母粉
（2） RNA标准溶液（100微克/毫升） （8） 5%硝酸银溶液
（9）钼酸铵试剂2克钼酸铵溶解在100毫升10% 硫酸中。
（10）地衣酚试剂：100毫升浓盐酸加入100毫克三氯化铁，摇匀，贮存备用，使用前加入100毫克地衣酚。 ? （11） NaCl ? （12） 95%乙醇
? （13） 6 mol/l HCl ? （14）高氯酸 ? （15）氯化锂
? （16）硼酸缓冲液（pH-3.5） ? （17）磷酸缓冲液（pH-7.5）
2、器材
（1）电子天平 （2）电热套 （3）三角烧瓶 （4）烧杯 （5）高速冷冻离心机 （6）滴管 （7）抽滤瓶 （8）离心管 （9）恒温水浴箱
（10）吸量管 （11）紫外分光光度计
（12）表面皿 （13）量筒 (14）容量瓶 （15）擦镜纸 （16）比色皿 （17）玻棒 （18）定量滤纸 （19）试管
（20）布氏漏斗 （21）真空泵 （22）电泳仪
? （23）紫外检测仪（24）可见光分光光度计
? （25）托盘天平 （26）电泳槽 (27)0.5-5.0精密pH试纸 四、实验方法 RNA的提取的操作
3、 RNA提取方法(浓盐法) ①取 13g活性干酵母,置250 ml烧杯中，加入120 ml蒸 馏水，混匀； ②倒入8 g NaCl，电热套加热45分钟(玻棒要不断触底搅拌) ； ③稍微冷，3500 rpm离心8 min，将上清倒入50 ml烧杯 中。 ④ 将烧杯冰浴10 min
⑤用HCl小心调节pH，至2.0～2.5； ⑥将烧杯冰浴10 min；
⑦将烧杯中物质（含沉淀）移入10 ml离心管中， 3500 rpm离心8 min，弃上清，
⑧将沉淀转移到1.5ml小离心管中，95%乙醇1.5 ml洗涤,5000 rpm离心4 min,倒弃清液。 ⑨保存好粗RNA产品。
思考题
RNA含量测定之一：地衣酚法 RNA的地衣酚法定量测定原理
RNA含量测定之一：地衣酚法测定。
反应原理：当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚 orcinol）反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在670 nm处有最大吸收。RNA浓度在20-250μg/ml范围内，光密度与RNA浓度成正比。 ? （1）标准曲线的制作
取6支试管，7按下表编号及加入试剂，加毕混匀，置沸水浴中加热45 min，取出冷却，于670nm波长处测定光密度值。 （3）RNA含量的计算
? 根据测得的O.D值，从标准曲线上查出相对应的RNA含量，按下式计算出制品中RNA的百分含量： ? RNA%=
RNA鉴定之一：组成基团的鉴定
? 实验步骤:
? 取适量0.05 g提取的RNA，加10%硫酸液3 ml，放在沸水浴中加热5分钟，制成RNA水解，做以下鉴定
? （1）嘌呤碱基的检查
取水解液0.5ml，加氨水0.5ml及5%硝酸银溶液0.3ml，观察是否产生絮状嘌呤银化合物（有时絮状物出现较慢，可放置十几分钟）。
（2）磷酸的检查
取水解液0.5 ml，加2滴浓硝酸酸化，再加入0.5 ml钼酸铵试剂，放在沸水浴中加热10分钟，冷却静置后观察是否有黄色磷钼酸铵沉淀产生。
（3）核糖的检查